利用模块共培养工程和途径再平衡技术显著提
发布时间:2021-7-21 16:07:07 点击数： 次
传统的单一菌株通过基因工程改造以及关键酶平衡表达来构建最佳途径重定向。这种工程技术依赖于质粒拷贝数、启动子强度、UTR序列等，这些因素比较复杂，不容易在单一菌株中适当保持。因此，单一菌株易出现氧化还原失衡，承受额外的代谢负担。通过开发高性能共培养系统，可以有效地解决这一问题。近日，江苏大学食品与生物工程学院齐向辉教授团队于ACSSustainableChemistryEngineering杂志上发表了题为NotableImprovementof3?HydroxypropionicAcidand1,3-PropanediolCoproductionUsingModularCocultureEngineeringandPathwayRebalancing的研究论文。该研究通过模块化共培养工程、途径再平衡技术以及改良的分批和补料分批实验，提高了全细胞甘油生物催化过程中3-羟丙酸（3-HP）和1,3-丙二醇（1,3-PDO）的协同生产。在大多数菌株中（大肠杆菌）3-HP和1,3-PDO生产通常利用甘油通过依赖于辅酶维生素B12的甘油脱水酶(GDHt，由dhaB编码)转化为代谢中间体3-羟丙醛(3-HPA)。3-HPA通过NAD+依赖的醛脱氢酶（AldH）转化为3-HP，而1,3-PDO通过NADH依赖的氧化还原酶(PDOR,dhaT编码)催化生成的。相比之下，罗伊氏乳杆菌需要三种酶将3HPA转化为3-HP，分别是丙醛脱氢酶(pduP)、磷酸转乙酰化酶(pduL)和丙酸激酶(pduW)。与其它生产菌株相比，罗伊氏乳杆菌具有非致病性和益生菌等一些特性。由于罗伊氏乳杆菌产生3-HPA的速度是生产两种目标产物的10倍，如果使用这种菌株的单一培养，就会导致3-HPA的积累造成细胞活性降低。而大肠杆菌中由于缺乏合成维生素B12的途径，需要添加昂贵的维生素B12激活GDHt的活性去催化甘油的转化。所以通过共培养，使罗伊氏乳杆菌在细胞外产生3-HPA，然后通过其天然途径转化为3-HP和1,3-PDO，而大肠杆菌菌株(表达GabD4和PduQ)中的另一条外源3-HPA转化途径进一步加快了3-HPA的转化，实现3-HP和1,3-PDO的协同高产。通过该方法研究人员设计了6种共培养类型，在一定条件下，分析六种类型中代谢产物的最终浓度，选择最佳共培养体系（CS-2）。进一步优化共培养的工艺条件，主要考虑三种关键因素：DCW浓度、甘油负荷和生物转化时间。结果发现CS-2的3-HP和1,3-PDO产量在所有条件下均显著增加，直到4h。DCW浓度从20g/L上升到30g/L，3-HP和1,3-PDO滴度在3小时前升高。相反，DCW浓度高于20g/L时，3-HP和1,3-PDO滴度在最佳时间(4小时)的变化不显著。此外，在最高DCW浓度(30g/L)和甘油浓度(60g/L)时，3-HP和1,3-PDO产量急剧下降。代谢物产量的下降可能是因为在较高的甘油负荷下，较高的DCW浓度会导致反应混合物中的细胞和底物过度拥挤。它最终影响了系统内细胞、酶、底物分子和代谢中间体的适当扩散。然而，当DCW浓度最低(20g/L)时，3-HP和1,3-PDO的生物合成继续增加，直到最高的甘油负荷(60g/L)。由于在共培养体系中3-HPA依旧还会积累，可能原因是AldH和PduQ之间的不平衡表达，作者进一步对gabD4进行5’-UTR工程改造，提高其表达水平。作者构建了不同5’-UTR序列的质粒，发现在CS-2V3中，AldH和PduQ平衡良好。为进一步提高3-HP和1,3-PDO产量，提出了甘油生物催化的最先进的技术配置，通过连续添加新鲜细胞和甘油可显著提高甘油消耗量，最终甘油的消耗量从30g/L提高到g/L，使3-HP+1,3-PDO的净效价从25.11g/L提高到.39g/L。（耿珊珊摘译）licme
