缺少浓缩底物的位点是限制纳米酶发展的主要问题之一，适配体结合位点和纳米酶间共价键可仿照天然酶结合和催化位点的功能，浓缩纳米酶周围的反应底物。这一理念可以应用于开发具有不同催化活性的适配体-纳米酶混合体库，为基于DNA的催化提供一种通用的合成多相催化剂的方法。
研究内容
引入一组DBA修饰的Cu2+离子功能化的碳点和一组TBA修饰的Cu2+离子功能化的碳点被作为具有卓越催化活性的apta纳米酶，分别用于多巴胺的氧化或L-酪氨酰胺的氧化。在H2O2存在下，DBA修饰的Cu2+功能化碳点催化氧化多巴胺生成氨基色素。在H2O2和抗坏血酸(AA)混合物存在下，TBA修饰的Cu2+功能化碳点存在下催化L-酪氨酸酰胺氧化生成邻苯二酚，随后氧化生成酰胺色素。
图1(A)适配体修饰的Cu2+功能化碳点-aptananozyme的示意图合成。(B)合成aptananozymes驱动的化学转化示意图。(多巴胺氧化酪氨酸酰胺氧化)用一系列不同DBA修饰的Cu2+功能化碳点（图2A所示）催化多巴胺氧化，其中打乱的DBA碱基序列修饰的Cu2+功能化碳点的催化效率比分散的的Cu2+功能化碳点和DBA要高，这可能是由于质子化的多巴胺和带负电的碳点间静电作用导致底物局部浓度靠近催化界面。apta纳米酶对多巴胺的氧化率表现出对与Cu2+离子功能化碳点相连的DBA成分结构的依赖性，与DBA-5末端相连的碳点催化活性优于与-3末端相连的；通过比较解离常数Kd可知，这可能是由于多巴胺底物与DBA-3末端相连的碳点结合亲和力较低。DBA-5末端修饰的apta纳米酶活性还被桥联间隔单位长度影响，与(TGTA)(TGTA)2相连的碳点催化活性优于直接相连纳米酶，但在(TGTA)3出现下降。其中有(TGTA)(TGTA)2纳米酶的Kd值与直接相连纳米酶非常接近，故推测催化活性提高可能是由于间隔单位的存在提高空间灵活度，为DBA复合物和催化氧化的核心提供了增强的空间邻近性。而(TGTA)3的低催化能力则是由于对底物亲和力低。图2A：用来催化多巴胺氧化成氨基色素的一系列apta纳米酶；B：利用不同浓度的多巴胺，在H2O2存在下，一系列apta纳米酶催化氧化多巴胺为氨基色素的速率
基于适配子链的手性推测apta纳米酶可能可以进行具有手性选择性的催化转化，DBA-5末端修饰的apta纳米酶催化的L-或D-DOPA的手性选择性氧化证实了这一点。
核酸适体对L-DOPA和D-DOPA的非对映异构体区分导致L-DOPA氧化L-多巴色素，而D-DOPA氧化为D-多巴色素。与D-DOPA相比，适配体对L-DOPA的亲和力要高得多。作为对照组，曲线(c)和(d)显示了在分离的Cu2+离子修饰碳点和DBA存在下L-DOPA和d-DOPA的氧化速率。
图3(a)/(b)分别对应于在不同浓度的L-DOPA/D-DOPA存在时，apta纳米酶催化H2O2氧化L-DOPA生成L-多巴色素或氧化D-DOPA生成D-多巴色素。(c,d)使用分离的apta纳米酶和适配体(1)L-dopa和d-dopa在不同浓度的L-/d-dopa分别被H2O2氧化的速率。
与图2相似，合成另一种用TBA修饰的Cu2+功能化碳点，证明了这一概念的多元性。
图2A：用来催化L-酪氨酸酰胺氧化生成邻苯二酚，随后氧化生成酰胺色素的一系列apta纳米酶；B：利用不同浓度的L-酪氨酸酰胺，在H2O2和AA存在下，一系列apta纳米酶催化氧化L-酪氨酸酰胺的速率
用电子自旋共振(ESR)光谱评估了Cu2+修饰的碳点在H2O2或H2O2/AA存在下生成的可能的活性氧簇——分别用于催化多巴胺氧化为氨基色素或L-酪氨酸酰胺的C-H键氧化。用TBA修饰的Cu2+修饰的碳点催化氧化，在H2O2水溶液中生成羟基自由基(·OH)；在AA溶液中，生成抗坏血酸自由基AA·；H2O2和AA的混合物中，会生产抗坏血酸自由基AA·和过氧自由基·OOH的混合物，而不会形成·OH基团；将L-酪氨酸酰胺底物添加到H2O2/AA的混合物中，形成两个中间产物AA·和·OOH，反应混合物中·OOH的含量受到抑制，而AA·的含量几乎不受影响。表明，·OOH是碳氢键氧化反应中的一种活性物质。
这些结果证明，多巴胺氧化过程中的活性物种是羟基自由基·OH，而由TBA修饰的Cu2+离子功能化碳点在AA/H2O2溶液中产生的AA·和·OOH的混合物参与了L-酪氨酸酰胺的C-H键氧化。
图5A,不同溶液中，apta纳米酶生成的氧自由基的ESR谱图；B,Cu2+功能化的碳点氧化L-酪氨酸酰胺的Ar-H键生成儿茶酚的循环机制
总结
综上所述，本研究引入了apta纳米酶的概念，即将序列特异性适配体链与纳米多相催化剂结合，以增强纳米酶的催化活性。通过适体-底物复合物将反应底物结合在催化剂核心，提供了一种类似于天然酶的将底物集中到催化界面附近的方法。且通过开发不同种类apta纳米酶证实这一概念。并且通过对核酸适配体序列的结构工程，验证了该酶的可控催化功能。本研究将之前的报告过的均相金属有机配合物-核酸适体缀合物(核酶)概念扩展到多相催化剂。并提出可通过将适配体与其他催化纳米颗粒结合，特别是将适配体与其他金属离子修饰的碳点结合，以驱动其他催化反应，为开发多种apta纳米酶铺平了道路。
参考文献：OuyangY,BiniuriY,FadeevM,ZhangP,CarmieliR,Vazquez-GonzalezM,etal.Aptamer-ModifiedCu2+-FunctionalizedC-Dots:VersatileMeanstoImproveNanozymeActivities-"Aptananozymes".JournaloftheAmericanChemicalSociety.;(30):-9.
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