摘要：目的研究TRAIL基因修饰的脐带间充质干细胞（TRAIL-MSCs）联合化疗药5-氟尿嘧啶（5-FU）对人脑胶质瘤细胞U-87MG、人肺癌细胞A和人宫颈癌细胞HeLa的杀伤作用。方法通过基因工程手段结合慢病毒转染体系构建高表达十二聚体TRAIL蛋白（dTRAIL）的TRAIL-MSCs，应用流式细胞技术检测TRAIL-MSCs的生物学特性；通过ELISA技术检测TRAIL-MSCs分泌的TRAIL量来评估转染效果；CCK-8法检测低浓度（0、1、2、4、8、16μg/mL）5-FU对U-87MG、A、HeLa细胞的增殖抑制率，并计算其对各细胞的半数抑制浓度（IC50）；CCK-8法检测5-FU（IC50）、UC-MSCs培养上清、TRAIL-MSCs培养上清、5-FU（IC50）＋UC-MSCs培养上清和5-FU（1/4IC50、1/2IC50和IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清对U-87MG、A、HeLa细胞的增殖抑制率，计算5-FU和TRAIL-MSCs培养上清的相互作用系数（CDI）；Westernblotting法检测5-FU对U-87MG、A、HeLa细胞死亡受体DR4、DR5蛋白表达的影响；台盼蓝染色法观察5-FU、UC-MSCs、TRAIL-MSCs、5-FU＋UC-MSCs和5-FU＋TRAIL-MSCs对U-87MG、A、HeLa细胞的杀伤作用。结果生物学检测结果表明TRAIL-MSCs在维持UC-MSCs生物学特性的同时能够高表达TRAIL蛋白。5-FU对U-87MG、A、HeLa细胞均有增殖抑制作用，抑制作用由高到底依次为HeLa细胞（IC50为9.15μg/mL）＞A细胞（IC50为10.62μg/mL）＞U-87MG细胞（IC50为22.37μg/mL）。与对照组比较，除A细胞UC-MSCs培养上清组外，各处理组细胞增殖抑制率均显著升高（P＜0.01、0.）；与相应各5-FUIC50及TRAIL-MSCs培养上清组比较，U-87MG、HeLa细胞5-FU（1/4IC50、1/2IC50和IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清组细胞增殖抑制率均显著升高（P＜0.），A细胞5-FU（IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清组细胞增殖抑制率显著升高（P＜0.01、0.）；5-FU（1/2IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清组对U-87MG的细胞增殖抑制协同效应最显著（CDI＜0.7且P＜0.）；5-FU（1/4IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清组对A的细胞增殖抑制具有协同作用，但其协同效果并不显著；5-FU（1/4IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清组对HeLa细胞增殖抑制的协同效果最显著（CDI＜0.7且P＜0.01）。经5-FU处理后U-87MG、A、HeLa细胞DR4和DR5的蛋白表达明显升高，其中DR5的表达水平高于DR4，与对照组比较差异均具有统计学意义（P＜0.）。与对照组比较，5-FU、TRAIL-MSCs和5-FU＋TRAIL-MSCs组对于肿瘤细胞U-87MG、A、HeLa均具显著的杀伤作用（P＜0.）；与5-FU或TRAIL-MSCs组比较，5-FU＋TRAIL-MSCs组的杀伤效果更显著（P＜0.）。结论TRAIL-MSCs联合低浓度的5-FU对肿瘤细胞U-87MG、A和HeLa具有显著的细胞杀伤作用，二者联用协同效果显著，机制可能与5-FU提高DR4、DR5蛋白表达、提高肿瘤细胞对TRAIL-MSCs的敏感性相关。
5-氟尿嘧啶（5-FU）在20世纪60年代中期首次作为抗癌抑制剂使用，此后一直是实体瘤治疗中最常见的药物［1］。5-FU在给药时转化为活性代谢物氟脱氧尿苷一磷酸（FdUMP）、氟脱氧尿苷二磷酸（FdUDP）和氟脱氧尿苷三磷酸（FdUTP），5-FU作用的中心机制是FdUMP对胸苷酸合成酶的抑制，而FdUDP和FdUTP可以作为嘧啶类似物掺入RNA和DNA中，导致细胞中毒和死亡［2］。尽管5-FU表现出对DNA合成的抑制活性，但由于其亲水性和二氢嘧啶脱氢酶的快速代谢，导致其临床治疗效果有限。而为达到临床治疗效果则需连续给予高剂量的5-FU，从而对胃肠道、血液、神经、心脏和皮肤产生严重的毒性作用［3］。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）又称载脂蛋白2L（Apo2L），属于肿瘤坏死因子家族，通过与其死亡受体DR4或DR5结合来激活凋亡级联反应，从而诱导肿瘤细胞凋亡［4-5］。在大多数肿瘤细胞系中除了外源性凋亡途径，科学家还发现TRAIL诱导的凋亡信号需要通过Bcl-2调节的线粒体途径，从内源性凋亡途径的激活中增强其对肿瘤细胞凋亡的诱导效果［6-7］。无论是外源性还是内源性凋亡途径，TRAIL不会在正常组织中引起副作用［8］。研究证实TRAIL基因修饰间充质干细胞（TRAIL-MSCs）在体外能够通过内源性与外源性凋亡途径同时对非小细胞肺癌细胞系H和H细胞进行增殖抑制、细胞凋亡以及死亡的诱导作用［9］。然而，临床试验表明TRAIL蛋白因其体内半衰期短、肿瘤靶向性差以及对单一疗法的耐药性等原因导致有效性不足［10-13］。因此需要用敏化剂联合治疗来增强TRAIL的抗肿瘤潜力［14］。研究表明，组蛋白乙酰转移酶抑制剂A提高H和HCC细胞对TRAIL的敏感性［15］。5-FU预处理能够通过上调DR5和下调生存素使肝癌细胞对TRAIL介导的凋亡敏感［16］。
本研究通过基因工程结合慢病毒载体转染脐带间充质干细胞（UC-MSCs）得到TRAIL-MSCs，联合应用化疗药物5-FU来验证5-FU/TRAIL-MSCs对人脑胶质瘤细胞U-87MG、人肺癌细胞A和人宫颈癌细胞HeLa的杀伤作用。并期望通过对敏化剂5-FU和TRAIL联合用药的研究为人类实体肿瘤提供一种有效的治疗方案。
1 材料
1.1 细胞
U-87MG、A和HeLa细胞均购于中国医学科学院基础医学研究所。
1.2 主要试剂
DMEM高糖培养基、DMEM/F-12培养基、胎牛血清以及胰蛋白酶，购于美国ThermoFisher公司；TRAIL蛋白ELISA检测试剂盒，RDSystem；CCK-8试剂盒，日本东仁化学科技有限公司；5-FU，货号MKCL，美国默克公司；TRAIL受体DR4、DR5抗体、GAPDH抗体，英国Abcam公司；Westernblotting蛋白裂解液RIPA、PMSF，美国CST公司；5×loadingbuffer，中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；二抗GoatAnti-RabbitIgGHL（HRP），ab，英国Abcam公司；Marker，美国Bio-Rad公司。台盼蓝，RNBK，美国默克公司。
1.3 主要仪器
SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；CX41倒置显微镜，奥林巴斯株式会社；Calibur双激光四色流式细胞仪，美国BD公司；IC自动细胞计数仪，上海思默生物科技有限公司；ST16R台式冷冻离心机、细胞培养箱及酶标仪、CL成像系统，美国ThermoFisher公司。
2 方法
2.1TRAIL-MSCs制备
UC-MSCs的获得及检测、TRAIL质粒构建及慢病毒转染UC-MSCs获得TRAIL-MSCs的方法参考本课题组已建立方法［17］。
2.2TRAIL-MSCs细胞生物学功能检测
根据国际细胞治疗学会标准，应用流式细胞技术分别检测UC-MSCs和TRAIL-MSCs表面标志物CD19、CD34、CD11b、CD73、CD90、CD45、CD、HLA-DR的表达情况。
2.3TRAIL蛋白表达检测
将UC-MSCs和TRAIL-MSCs分别以1.5×个接种于T75细胞培养瓶中，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养48h后收集细胞培养上清液。应用ELISA试剂盒检测上清液中TRAIL蛋白的表达量，具体操作参考试剂盒说明书。
2.45-FU对肿瘤细胞U-87MG、A、HeLa的增殖抑制作用
通过文献检索［18-19］，本研究选用低浓度（0、1、2、4、8、16μg/mL）5-FU进行梯度试验。将U-87MG、A、HeLa细胞分别以1×/孔接种于96孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。各细胞均分为对照组和5-FU各浓度组，每组设置6个复孔。24h后吸弃细胞培养液，加入μL/孔相应的含药培养液继续培养24h后，采用CCK-8试剂盒检测细胞活力，酶标仪检测nm波长处的吸光度（A）值，并计算细胞增殖抑制率及半数抑制浓度（IC50）。
细胞增殖抑制率＝1－A5-FU/A对照
2.55-FU联合TRAIL-MSCs培养上清对U-87MG、A、HeLa细胞的增殖抑制作用
以1×/孔将U-87MG、A、HeLa细胞分别接种于96孔板中，分为8组：对照组（DMEM培养液）、5-FU（IC50）组、UC-MSCs培养上清组、TRAIL-MSCs培养上清组、5-FU（IC50）＋UC-MSCs培养上清组和5-FU（1/4IC50、1/2IC50和IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清组，且每组各6个复孔，并置于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜。各肿瘤细胞分别以浓度为1/4IC50、1/2IC50和IC50的5-FU预处理24h后，吸弃培养液，对应加入培养了48h的UC-MSCs和TRAIL-MSCs培养上清液（制备方法见“2.3”项），继续培养48h，而对照组则用DMEM培养基培养，5-FU组则采用浓度为IC50的5-FU细胞培养液培养。采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况，计算细胞增殖抑制率，并根据细胞活力（波长为nm的A值）计算5-FU和TRAIL-MSCs培养上清的相互作用系数（CDI），并对其进行药物联合作用评价，相关计算公式以及CDI显著性分析参照文献方法进行［20-21］。
2.65-FU对DR4、DR5蛋白表达的影响
将U-87MG、A、HeLa细胞各分为对照组（DMEM培养基）和5-FU组（根据CDI结果将U-87MG、A、HeLa细胞的5-FU浓度依次选定为1/2IC50、1/4IC50和1/4IC50），每组设置3个复孔。3种细胞分别按5×/孔接种于6孔板中，过夜培养后吸弃培养液，加入含药培养液继续培养48h。收集细胞提取蛋白，检测TRAIL相关死亡受体DR4和DR5的表达情况，Westrenboltting实验方法详见文献报道［22］。图像定量分析使用ImageJ软件进行。
2.75-FU联合TRAIL-MSCs对肿瘤细胞U-87MG、A、HeLa的杀伤作用
将U-87MG、A、HeLa细胞分别设置为对照组（DMEM培养液）、5-FU组、UC-MSCs组、TRAIL-MSCs组、5-FU＋UC-MSCs组和5-FU＋TRAIL-MSCs组，每组设置3个复孔。细胞以5×/孔接种于6孔板中，培养过夜后吸弃培养液，对照组、UC-MSCs组和TRAIL-MSCs组分别加入2.5mLDMEM培养基，UC-MSCs和TRAIL-MSCs组在Transwell上室接种2.5×/孔的UC-MSCs、TRAIL-MSCs与各肿瘤细胞共培养；而5-FU、5-FU＋UC-MSCs和5-FU＋TRAIL-MSCs组分别加入含相应浓度的5-FU（U-87MG、A、HeLa细胞的5-FU浓度依次选定为1/2IC50、1/4IC50和1/4IC50）培养液预处理24h后，吸弃含有5-FU的细胞培养液，5-FU＋UC-MSCs和5-FU＋TRAIL-MSCs组以2.5×/孔的UC-MSCs、TRAIL-MSCs接种于Transwell上室中并与各肿瘤细胞系进行共培养，继续培养48h后，显微镜下观察细胞形态；采用台盼蓝细胞染色计数法［22］检测各处理方法对U-87MG、A、HeLa细胞的杀伤情况，计算死细胞百分比，5-FU+TRAIL-MSCs组实验方法见文献报道［22］。
死细胞百分比=1-实验组活细胞总数/对照组活细胞总数
2.8 统计学处理
计量结果以±s表示，采用SPSS26.0统计学软件进行数据结果分析，使用单因素方差分析以及t检验。
3 结果
3.1TRAIL-MSCs细胞表型检测
以UC-MSCs为对照，对TRAIL-MSCs进行细胞表型鉴定，结果表明细胞表面标志物CD19、CD34、CD11b、CD45和HLA-DR的阳性率均＜2%；而CD73、CD90、CD的阳性率均＞95%，说明TRAIL基因修饰并未改变载体细胞UC-MSCs的细胞表型（表1）。
3.2TRAIL-MSCs分泌TRAIL蛋白水平的检测
如图1所示，与UC-MSCs组比较，TRAIL-MSCs可高表达TRAIL蛋白，1×个细胞TRAIL蛋白表达量达到20ng，且差异具有统计学差异（P＜0.）。
3.35-FU对U-87MG、A、HeLa的细胞增殖抑制作用
5-FU对U-87MG、A、HeLa细胞均有细胞增殖抑制作用，抑制作用由高到低依次为HeLa细胞（IC50为9.15μg/mL）＞A细胞（IC50为10.62μg/mL）＞U-87MG细胞（IC50为22.37μg/mL），但各细胞间5-FU的IC50无明显差异（图2）。
3.4TRAIL-MSCs培养上清与5-FU对U-87MG、A、HeLa细胞增殖抑制的联合作用评价
TRAIL-MSCs培养上清与5-FU联合细胞增殖抑制率结果见图3，联合用药作用结果见表2。与对照组比较，除A细胞UC-MSCs培养上清组外，各处理组细胞增殖抑制率均显著升高（P＜0.01、0.）。与相应各5-FUIC50及TRAIL-MSCs培养上清组比较，U-87MG、HeLa细胞5-FU（1/4IC50、1/2IC50和IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清组细胞增殖抑制率均显著升高（P＜0.），A细胞5-FU（IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清组细胞增殖抑制率显著升高（P＜0.01、0.）。
不同浓度的5-FU与TRAIL-MSCs培养上清对U-87MG细胞的CDI均＜1，表明均具有协同作用；5-FU（1/2IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清组对U-87MG的细胞增殖抑制协同效应最显著（CDI＜0.7且P＜0.）；5-FU（1/4IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清组对A细胞的CDI＜1，其余组CDI＞1，表明仅5-FU（1/4IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清组对A的细胞增殖抑制具有协同作用，但其协同效果并不显著；不同浓度的5-FU与TRAIL-MSCs培养上清对HeLa细胞的CDI均＜1，表明均具有协同作用；以5-FU（1/4IC50）＋TRAIL-MSCs培养上清组的协同效果最显著（CDI＜0.7且P＜0.01）。
3.55-FU对DR4、DR5蛋白表达的影响
如图4所示，在无化疗药5-FU处理的情况下，U-87MG、A、HeLa细胞的TRAIL死亡受体DR4和DR5均有表达，且各肿瘤细胞对于TRAIL的敏感性大致为U-87MG＞HeLa＞A；在经5-FU处理后DR4和DR5的表达明显升高，其中DR5的表达水平高于DR4，与对照组比较差异均具有统计学意义（P＜0.）。
3.6TRAIL-MSCs联合5-FU对U-87MG、A、HeLa细胞的杀伤作用
不同方式处理肿瘤细胞后，通过显微镜观察细胞形态及密度，结果如图5所示，与对照组比较，各处理组对肿瘤细胞均有一定的杀伤作用，其中以5-FU＋TRAIL-MSCs组的杀伤作用最明显。
各处理组死细胞百分比结果如图6所示，与对照组比较，5-FU、TRAIL-MSCs和5-FU＋TRAIL-MSCs组对于肿瘤细胞U-87MG、A、HeLa均具显著的杀伤作用（P＜0.）；与5-FU或TRAIL-MSCs组比较，5-FU＋TRAIL-MSCs组的杀伤效果更显著（P＜0.）。因各肿瘤细胞对TRAIL的敏感性不同，且TRAIL-MSCs自身也能够通过提高DR5的表达量来增加肿瘤对TRAIL的敏感性，TRAIL-MSCs对于U-87MG、A、HeLa细胞表现出不同的杀伤效果；其中联合用药组对U-87MG、HeLa细胞杀伤作用强于A，这与5-FU对肿瘤细胞U-87MG、A、HeLa的增敏作用保持一致，该结果充分证明了5-FU和TRAIL-MSCs的联合应用可明显增强TRAIL的杀伤作用。
4 讨论
细胞内代谢是5-FU的功效和毒性的核心，只有一小部分给药剂量转化为活性代谢物FdUMP、FdUDP和FdUTP，而80%～90%的5-FU被转化为无活性的代谢物5，6-二氢5-FU，因此易出现高剂量耐药性，而使其治疗效果受到限制［23］。5-FU在抑制癌细胞增殖的同时也抑制其他快速增殖的细胞，从而导致心脏毒性、胃肠道紊乱、血小板减少、中性粒细胞减少以及皮肤病等一系列副作用［24-26］。相关研究表明，抗癌化疗药物以及TRAIL介导的凋亡可能共享其细胞内共同的信号通路，可以通过TRAIL/化疗药物的联合治疗而提高肿瘤治疗的敏感性［27］。因此，TRAIL/5-FU联合疗法可能在实体肿瘤的治疗中存在一定的临床应用前景。
目前，抗肿瘤药的临床应用受到其高毒性或生物半衰期短的限制。因MSCs显示出向肿瘤部位归巢的能力，且MSCs能够通过抑制血管生成、促进炎症浸润、凋亡和细胞周期停滞以及抑制AKT和Wnt信号通路来抑制肿瘤生长，使得MSCs作为癌症治疗的细胞载体备受
