RT-PCR,反转录·聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)是将RNA的反转录(reversetranscription)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
对于RT-PCR反应而言,“酶”起着至关重要的作用,并且每一种“酶”都具有不同的活性和功能。那么,都有哪些种类的酶呢?在IVD领域中又有哪些应用呢?
M-MLV逆转录酶定义:该酶以RNA为模板,按5-3方向合成一条与RNA模板互补的DNA单链的酶。
主要活性及作用:
1、RNA指导的DNA聚合酶活性。
2、RNaseH活性
3、以DNA指导的DNA聚合酶活性。
在IVD领域的应用:
1、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)
2、cDNA文库构建
3、RNA测序
4、RT-qPCR,新冠核酸检测所配置的体系试剂当中,必然会加入逆转录酶。因为RNA病毒必须逆转录为DNA,才能进行PCR反应。
M-MLV逆转录酶
DNA聚合酶定义:它是以DNA为模板,从DNA5端复制到3端,催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。
主要活性及作用:催化DNA合成,具有5→3聚合酶活性和5→3外切酶活性,无3→5外切酶活性。
在IVD领域中常见的DNA聚合酶包括:TaqDNA聚合酶,热稳定性高,耐受血液及其它抑制物,适用于各种类型靶标模板的快速PCR反应;热启动TaqDNA聚合酶,通过抗体法或配体法等方式对DNA聚合酶进行修饰而成,使得DNA聚合酶活性在预变性温度下才被激活,可抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。
TaqDNA聚合酶
热启动TaqDNA聚合酶
UDG酶/HL-UDG酶定义:别名是尿嘧啶-DNA糖基化酶/尿嘧啶-DNA糖基化酶(热敏),也称为UDG酶/HL-UDG酶。HL-UDG酶与普通UDG酶相比,避免了常规UDG酶灭活后可能存在的残留活性在常温下对含dU扩增产物的降解作用。HL-UDG酶在室温下起作用,且对温度敏感、易于灭活。
作用:高效控制PCR残余污染。
在IVD领域中应用:在临床检验的PCR试剂中含有UDG酶/HL-UDG酶,以防止污染。
UDG酶
HL-UDG酶
RNase抑制剂定义:该酶是在大肠杆菌中表达纯化的重组鼠源RNase抑制剂,可通过非竞争方式1:1与RNaseA、B或C结合,从而抑制三种酶的活性。
作用:保护RNA不被降解。
在IVD领域中应用:在RT-PCR、RT-qPCR检验中,能与各类商业化逆转录酶及各种DNAPolymerase兼容。
RNase抑制剂