基于荧光激活细胞分选（FACS）的酶活性超高通量筛选体系开发与应用
P1
亲爱的观众朋友，大家晚上好，我就是传说中的美女博士，我叫谭玉萌，来自上海交通大学，今天给大家分享的是“基于荧光激活细胞分选（FACS）的酶活性超高通量筛选体系开发与应用”，简言之“流式细胞仪在酶改造中的应用”。在开始报告前呢，我先给大家讲一下为什么要将流式细胞仪应用于酶改造领域。
P2
说起酶呢，大家都不陌生，我们的衣食住行都离不开酶，上至医药/食品农业，下至环保、化工，就近几年兴起的代谢工程和合成生物学也离不开酶的催化。根据年统计发现，酶制剂全球产值60亿美元，推动下游产值在千亿美元以上，且品种和应用均处于快速增长阶段。
P3
但是呢，天然存在的酶常常存在催化效率低、跨物种匹配性差的缺点，因此常常需要蛋白质改造技术以实现效率最优化。
P4
定向进化技术在实验室中模拟自然进化中的关键步骤：突变、重组和筛选，获得具有所需性质的突变体。广泛地应用于提高酶地稳定性、底物特异性、立体选择性、酶活性等方面。
P5
筛选通量不足于突变库庞大数量之间地矛盾，是制约定向进化实验成功地最主要原因之一，举个例子，从高达10亿地突变库中筛选出三个有义突变，相当于海里捞针。那么，怎样才能最大程度地提高获得阳性突变体呢？
P6
传统地筛选方法，例如平板筛选、96筛选需要用到大量昂贵地底物，且每天只能筛选个突变体，筛选通量较低。为弥补现有筛选方法地不足，基于流式细胞仪的荧光激活细胞分选（FACS）筛选方法应运而生。流式细胞仪是专门用于单颗粒（如细胞、微球、微液滴等）高效检测的仪器，可以定量地提供单个颗粒大小、结构、荧光强度等信息，并能够从大量样品中分选出具有特定性质地群体。流式细胞仪具有极快地检测速度，在一个项目周期内可处理地样品可达个，因此也被称为“超高通量筛选方法”。
P7
下面主要介绍两种流式细胞仪在酶改造领域的应用，第一种是，胞内荧光捕获。这种方法首先是来自于加拿大的W……教授所开发。我先给大家简要地介绍一下这种方法的原理：荧光底物，它可以通过细胞表面的乳糖穿透酶，自由的进入细胞，在胞内酶的催化作用下生成产物。但是产物呢，由于结构和大小与底物不同，不能被细胞表面的乳糖穿透酶所识别，因此可以富集在细胞内。且信号强度的高低与酶的活性成正比，因此可以用流式细胞仪进行筛选。我们实验室的老师根据这种荧光捕获的原理将单荧光底物改成双荧光底物，这种双荧光底物的使用，可以避免酶对单一荧光底物的亲和力降低而导致假阳性的产生。就是说我们的荧光基团包括两部分，第一部分是底物，第二部分是荧光的基团。在筛选的过程中，有可能是我们的酶对荧光基团亲和力提高，而不是对底物亲和力提高。因此为了避免这种现象，我们开发了两种荧光底物！
P8
我们老师将这两种荧光底物应用到中性的糖基转移酶，β-1，3-半乳糖基转移酶CgtB。半乳糖基转移酶催化半乳糖从供体UDP-Gal到受体GM2，生成神经节苷脂GM1，GM1广泛地应用于治疗中枢神经系统损伤和神经退行性疾病。但这类酶地催化活力较低，制约了其应用。
P9
基于这个目的，我们开发了针对β-1，3-半乳糖基转移酶超高通量筛选方法。这种超高通量筛选方法用于这个酶之后，通过3轮的FACS筛选就将酶的催化活性提高30倍！大家可以看一下荧光富集图的横纵坐标，横坐标代表coumarin，它是代表一个荧光基团；纵坐标代表Bodipy，是另一种荧光基团。从初始的荧光的富集和3轮筛选后的荧光富集图，我们可以看到3轮筛选之后，coumarin和Bodipy的信号都明显增强，说明我们已经获得了良好的突变体。此外根据这种原理还可以应用于其他酶，现在我正在做的就是一种岩藻糖基转移酶，它应用于抗肿瘤药物，我们也开发了FACS筛选方法。我这个酶的活力也得到了很好的提升，一篇文章正在撰写中！
P10
流式细胞仪在酶改造领域的另外一种应用。也就是二级微液滴介导的IVC的FACS筛选体系。最早由是Tawfik和Griffiths建立，体外区室化（IVC）体系通过形成“油-水”（waterinoil）或“水-油-水”（waterinoilinwater）的微液滴来模拟天然细胞的结构，将编码酶的基因和无细胞蛋白质表达体系（或整个细胞），以及酶底物、产物全部包裹在同一微液滴中，从而建立基因型和表现型的欧联。IVC产生液滴的直径可小至1微米，在1mL的油相中即可轻易制备超过个微液滴，而且能够在较高温度下保持很长时间，这使得IVC成为高通量筛选的理想手段。
这种二级微液滴介导的IVC的FACS筛选方法用于提高巯基内酯酶的活性和半乳糖甘酶的活性，经过3轮的筛选获得了较好的突变体。
P11
液滴体系除了酶分子进化之外，还有潜力用于合成途径、分解途径、蛋白分泌等进化体系。其中的关键就是将所检测的目标转化为荧光信号，然后就可以进行FACS筛选。这里面有许多可以应用的技术，比如荧光底物和荧光探针、基于核酸适配体的生物传感器等。比如今年的Natbiotech上面发表一篇文章介绍了一种使用级联酶进行荧光检测的技术，通过目标化合物的氧化酶和辣根过氧化物酶进行活性偶联，可以实现多种代谢产物的荧光检测，比如氨基酸、脂肪酸、乳酸、木糖消耗等等，都可以通过这一体系进行筛选。
P12
我们实验室将这种微液滴的体系应用于嗜热酯酶AFEST的定向进化，通过两轮的筛选，就获得酶催化效率提高2倍的突变体。
P13
以上我们介绍了两种FACS酶活性筛选体系。第一种是胞内荧光富集，现在给大家复习一下胞内荧光富集的原理，这种胞内荧光富集原理就是根据酶的荧光底物可以自由的进入细胞，在酶的催化下生成产物，产物不能倍乳糖穿透酶识别，因此不能出细胞，这样一种原理进行筛选。
第二种呢，二级微液滴介导的体外区室化（IVC）体系，细胞形成油水，或水油水的微液滴来模拟天然细胞的结构，将编码酶的基因和无细胞蛋白质的体系包裹在同一个液滴内，从而建立基因型和表现型的偶联。
另外还有其他流式细胞仪的应用，例如细胞膜荧光吸附，荧光蛋白表达活性报告，基于细胞理化性质荧光探针活性报告，微珠介导的体外区室化。然后这四种应用大家了解一下就行，具体方法可查看文献。
P14
本期问与答
关于1、热稳定性改造；2、表达量提高的策略，
请
