蛋白样品的制备
一、总蛋白的提取
、将少量的剪碎的组织块置于2mlEP管中，加入清洗干净的钢珠。
2、每管加μl单去污剂裂解液裂解（含2μlPMSF、2μl磷酸酶抑制剂），置于自动匀浆机中匀浆（根据组织特性设置匀浆频率、匀浆时间以及匀浆次数）。
、匀浆完成后将EP管置于冰上0min充分裂解。
4、裂解0min后，即可用移液器将裂解液移至.5ml离心管中，然后在4℃下0rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
二、蛋白浓度的测定
、将蛋白样品进行适当稀释（样品各取μl，与PBS9μl混合进行稀释，即测试样品稀释20倍。
2、将BSA标准品进行稀释，制成蛋白浓度为，0.8，0.6，0.4，0.2标准蛋白（单位：mg/ml）。
、将PBS稀释过的蛋白样品、稀释过的标准蛋白分别加入96孔板内，标准品各设2个平行孔，待测样品设个平行孔，每孔加入体积20μl。加入PBS的2个平行孔为空白对照。
4、按50:比例将BCA试剂盒中A液和B液进行混合，将混合液加入96孔板内，每孔加入μl，注意不要产生气泡，以免影响反应。
5、7℃避光孵育5min。
6、用DG-A酶标仪测定OD。
7、根据标准蛋白浓度和相应的OD值计算直线回归方程，根据蛋白样品OD值，利用回归方程计算出样品蛋白浓度。具体数据见表。
三、蛋白变性
将提取的蛋白上清与5ⅹ蛋白上样缓冲液（体积比按照4:混合），放入沸水中进行沸水浴0min，检查样品是否透亮然后用移液枪吸取看是否粘稠，若不透亮或粘稠则需延长煮样时间。变性完后冷却至室温再放入-20℃保存。
电泳、电泳胶的制备
将玻璃板洗净擦干后，固定在制胶器上后，开始配分离胶，将分离胶灌入玻璃板空隙内到适当的高度，用无水乙醇覆盖分离胶，直至胶完全聚合。倒出无水乙醇，用双蒸水轻轻冲洗后用滤纸吸干。然后加入浓缩胶到合适的高度，插入梳齿。浓缩胶完全聚合后取出梳齿。
表电泳胶配置体系
凝胶浓度
成分
体积/ml
5%浓缩胶
6
水
4.
0%丙烯酰胺
.0
.0Mtris-HCl（pH6.8）
0.75
0%SDS
0.06
APS
0.06
TEMED
0.
2%分离胶
20
水
6.6
0%丙烯酰胺
8.0
.5Mtris-HCl（pH8.8）
5.0
0%SDS
0.2
APS
0.2
TEMED
0.
2、电泳分离
将制备好的胶固定到电泳槽上，储液池中倒入电泳液。用微量加样器将制备好的蛋白样品和MAKER加入上样孔，各样品总蛋白量为40μg。加样后先恒压80V电泳至溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，改为恒压20v至溴酚蓝到凝胶底部，此过程约用时.5h。
电转移取出凝胶根据Marker切下目的条带，用蒸馏水冲洗，剪与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜和滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，夹紧板后放入转膜仪内，黑色板的一面对照黑色负极。在转膜槽中加满电转液开始转膜。
免疫印迹显色：ECL显色系统、封闭
用含5%脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h。
2、一抗
用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。
、洗去多余一抗
TBST充分洗涤PVDF膜5次，5min/次。一个皿中最多放张膜，洗膜过程中注意膜是否贴到皿壁或膜是否重叠到一起。
4、二抗
用TBST稀释相应的HRP标记二抗---:稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温摇床孵育2h。
5、洗去多余二抗
TBST充分洗涤PVDF膜5次，5min/次。
6、显色曝光
将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按:比例混匀，滴加工作液于PVDF膜上，反应数分钟待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片。
结果分析晾干胶片，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。
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