「导读」
第一作者：王风华
通讯作者：秦慧民
单位：天津科技大学
摘要Abstract利用L-赖氨酸羟化酶可以合成用途广泛的合成中间体(2S,4R)-4-羟基赖氨酸。然而，野生型酶不能有效催化L-赖氨酸的C4羟基化生成产物。为了克服这一瓶颈，我们利用半组合活性位点饱和试验(CAST)对来自朝鲜尼亚斯氏菌(NiastellaKoreensis)的L-赖氨酸羟化酶(NkLH4)进行了修饰。获得了一株高活性突变体MT3(QN/TA/FY/ED)，与野生型酶(.33mM?1S?1相比于31.69mM?1S?1)相比，kcat/Km提高了24.97倍。通过分子动力学模拟进一步分析结构与活性的关系表明，MT3具有更灵活的构象，更大的底物结合口袋，在底物识别中空间位阻降低，结合能增加。本研究为生产对映体纯(2S，4R)-4-羟基赖氨酸提供了一个高活性的NkLH4突变体。THEEND研究意义羟基赖氨酸是一种通过翻译后修饰L-赖氨酸而来的氨基酸，是重要的医药中间体，可合成拮抗剂、酶抑制剂、免疫抑制剂等。相较于化学合成法而言，酶法在经济和环保两方面都有巨大的潜力。赖氨酸羟化酶可以以氧气为氧化剂催化羟基化反应，但是不同C位点的羟基化产物又会有不同的应用，目前还未有一种酶能有效的选择性催化C4位点的羟基化。本研究从朝鲜核桃属（N.koreensis）中分离了一种能催化L-赖氨酸C4位点羟化的酶NkLH4，然后运用组合活性部位饱和试验（CAST）对该酶进行结构修饰，构建突变文库，筛选出高活性突变体。在通过建模、分子对接、分子动力学模拟来鉴定和描述突变后菌株与野生株的差异。研究结果野生酶酶学性质分析：首先构建质粒，转化入大肠杆菌中并进行诱导表达，并用亲和层析和阴离子交换层析对表达产物进行纯化。将纯化产物进行电泳，结果与赖氨酸羟化酶理想分子量相符，之后用质谱测得准确分子量为42.91kDa，如（图2）。之后测量最适pH、最适温度、pH稳定性和温度稳定性，NkLH4最适pH为7.5，最适温度为25°C，pH在5.0-8.0内稳定性良好，温度45°C以下活力都能保持稳定（图1）。
图1.NkLH4的pH和温度性质图2.NkLH4的层析、电泳和质谱结果
NkLH4结构分析：以另一种L-赖氨酸羟化酶KDO5为模板建立NkLH4的模型，拉氏图证明模型可靠性高（图3）。根据模型条带图可知，NkLH4由7个α-螺旋、8个β-折叠和多个环组成（图4）。NkLH4是Fe(Ⅱ)/αKG依赖性的羟化酶，根据酶与底物的结合构象图可以看出，静止的Fe(Ⅱ)被来自保守基序His1-X-Asp/Glu-Xn-His2的两个His残基和一个Asp残基配位形成2-His-1-羧酸三联体，并与αKG结合形成高活性的Fe(Ⅳ)-氧代中间体，这个中间体可以对底物上的C-H键进行选择性激活，以此来进行催化反应。
图4.NkLH4结构模型。（a）酶分子的条带图。（b）酶与底物结构表面展示。（c）催化口袋放大图。图3.NkLH4的Ramachandran分析。
突变文库构建：经过序列比对（图5）以及结构分析，发现了活性部位的一些保守残基Q、T、D、F、D和E。将这六个残基两两组合来构建突变文库，共分为三个组，A组（Q，T）、B组（D，F）和C组（D，E），将这三个点用于组合活性位点饱和测试（CAST）以产生突变文库。首先以野生型酶WT为模板，从A组开始进行突变，发现双突变体MT1（QN/TA）的比活性是A组突变中最高的。之后以MT1为模板，在B组进行第二轮突变，发现突变体MT2（QN/TA/FY）的突变结果最好。最后以MT2为模板，在C组进行最后一轮突变，其中MT3（QN/TA/FY/ED）最好，比活提高了4.16倍，Km提高了7.22倍，kcat提高了24.97倍。最终的催化活性为.33mM-1S-1，相比于野生型WT的31.69mM-1S-1提高了很多。
图5.NkLH4与其他L-赖氨酸羟化酶的序列比对结果。
MT3突变体与NkLH4结构比较：分析了WT和MT3的底物结合口袋的结构信息，结果表明MT3比WT拥有更大的底物结合口袋（图6）。从WT与MT3底物结合口袋的氢键可以看出，WT中有7个氢键，而MT3只有4个，证明氢键的作用使得MT3的结构相较于WT更加灵活，拥有更大的底物活性口袋。通过WT与L-赖氨酸的整体对接构象分析，底物由Q、Q、H、E和结合铁离子的盐相互作用网络稳定。而MT3与L-赖氨酸的整体对接构象分析发现，突变之后L-赖氨酸羟基的O原子与R的氨基之间会形成一种独特的相互作用，会在反应过程中将底物吸引到口袋的末端（图7a,d）。辅因子的对接结果表明辅因子在WT中受到更多氨基酸残基以及盐桥的抑制作用（图7b,e）。产物的对接结果表明WT与MT3形成略有不同的相互作用，稳定产物的结合（图7c,f）。
图6MT3与WT的结构对比。（a,b）WT与MT3的表面展示图。（c,d）WT与MT3底物结合的氢键。图7WT和MT3分别与底物L-赖氨酸、辅因子αKG和产物的对接构象。分子动力学模拟：为了准确的解释MT3与WT的这种差异，将L-赖氨酸对接到WT和MT3的结合口袋中，进行ns的分子动力学模拟，MT3的结合能比WT显著增加，WT和MT3都达到了平衡状态，但MT3底物结合位点的一些环上面的残基比WT有更高的RMSF值，表明MT3中的结构有更大的灵活性。在ns的分子动力学模拟中记录的轨迹显示了WT和MT3中不同的空间构象（图8a-d）。结果表明，WT的底物通道比较狭窄，而MT3中由于氨基酸变形，形成了一个开放的空间，底物更容易进入催化中心，可能是由于TA的突变，减少了底物的空间位阻，增加了口袋的可用空间。WT与L-赖氨酸的复合物显示了一个狭窄的结合口袋，底物不容易深入，而是与活性位点口袋入口处的残基A、Q、G和D相互作用（图8e），而MT3与L-赖氨酸的复合物中，上述结构更加灵活，底物可以深入结合口袋，与埋在结合口袋内部的残基H、K和D相互作用（图8f）。此外观察到环-在底物结合时会发生构象变化（图9），更利于L-赖氨酸结合，是K残基更接近底物，并诱导K的羰基氧和L-赖氨酸的NH2之间的相互作用。
图8WT和MT3和底物结合的表面展示图和底物与残基的相互作用。图9WT和MT3分子动力学模拟衍生结构的带状表示。
主要结论通过半组合活性位点饱和测试(CAST)，我们获得了NkLH4的高活性突变体MT3(QN/TA/FY/ED)。以L-赖氨酸为底物，MT3的催化活性提高了4.16倍，催化转化率提高了3.67倍。然后，我们基于WT酶和突变体的详细结构，以及它们与底物、辅因子和产物的复合物，通过同源建模和分子对接，探索了MT3催化效率大幅提高的机理。结果表明，与WT相比，MT3的底物结合袋更宽、更开放，酶与底物之间的相互作用更强。分子动力学模拟还表明，活性位点周围的突变导致K-F和A-I环的移动和底物结合腔的扩大，从而使NkLH4与L-赖氨酸更接近，降低了底物分子的空间位阻，增加了底物结合自由能。通过对NkLH4的复杂突变体进行半理性设计，发现了一个高活性突变体，该突变体对未来(2S，4R)-4-羟赖氨酸的工业化生产具有潜在的商业价值。END「前期回顾」J.Agric.FoodChem.通过对催化口袋内的活性中心进行裁剪提高Bacillusnaganoensis中淀粉脱枝普鲁兰酶活力和稳定性
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