年8月31日，黑龙江大学和东北林业大学在《MicrobialEcology》上发表了“氮沉降对红松人工林氮矿化酶活性和土壤微生物群落结构的影响”的研究成果。该研究通过模拟氮沉降增加实验，揭示了土壤微生物群落结构和矿化酶活性对氮沉降的响应机制，为预测人工温带林土壤氮矿化酶活性和微生物群落结构随氮沉降增加的变化提供了更多的数据。
研究背景
随着工业化、化石燃料消费、化肥施用、固氮豆类种植和畜牧业的快速发展，自工业革命以来，全球陆地生态系统中活性氮的含量增加了两倍多，预计全球许多地区的活性氮含量还将进一步增加。中国已成为世界第三大氮沉降增加地区，缺氮森林生态系统中，增加氮沉降可以缓解系统中的氮素限制，提高植物生产力。然而，当氮沉降量超过生态系统阈值时，也会对生态系统造成一些负面影响。氮沉降可以通过改变土壤的物理化学性质来影响微生物群落的组成和多样性，土壤酶活性的测定可以间接了解某些物质在土壤中的转化情况。
红松(PinusKoraiensis)为针叶树，是国家二级重点保护野生植物，红松林是我国东北典型的温带森林类型，被称为“第三纪森林”，由于森林采伐，大量天然林被改造成人工林，中国黑龙江省伊春市命名红松为市树。在已发表的文献中有大量关于红松氮素沉降对红松影响的报道。然而，红松人工林土壤微生物群落结构对氮沉降的响应却知之甚少。
该研究通过模拟氮沉降增量试验，研究了红松人工林土壤微生物群落结构和矿化酶活性对氮沉降的响应，确定了土壤微生物群落结构和矿化酶活性对氮沉降的响应，确定了驱动土壤微生物群落结构和矿化酶活性变化的关键土壤因子，以确定增加氮沉降是否会改变土壤氮素含量并导致土壤酸化，从而影响红松人工林土壤微生物群落结构和矿化酶活性，旨在进一步阐明森林土壤微生物在全球气候变化背景下的响应机制提供数据。
材料和方法
研究地点：黑龙江伊春市凉水国家级自然保护区红松人工林
实验设计：共设4个处理，12个小区，3个重复。将硝酸铵(NH4NO3)溶液作为氮肥添加到4个氮肥水平：对照组(WN：不加氮)、低氮(LN：20kgNha?1year?1)、中氮(MN：40kgNha?1year?1)和高氮(HN：80kgNha?1year?1)。
土壤样本采集：用土壤取样器从每一样地的5个随机点采集土壤样本，然后混合在一起，每块地产生一个复合样本。每个处理都采集了3个样本，共采集了12个土壤样本。
黑龙江凉水国家级自然保护区
主要结果
01
土壤性质分析
通过单因素方差分析确定氮沉降对土壤性质的影响如表1所示。不同氮沉降水平对红松人工林土壤pH、速效磷、速效钾和全磷无显著影响。土壤有机质和NO3--N含量均随施氮量的增加而降低，但随着施氮量的增加，土壤有机质和NO3--N含量呈上升趋势。HN处理土壤有机质含量显著高于LN处理，HN处理的NO3--N含量显著高于MN处理，土壤全钾含量随施氮量的增加呈下降趋势，HN组TK含量显著低于WN组。
表1.氮沉降对红松人工林土壤性质的影响
02
土壤氮矿化酶活性测定
红松人工林在不同氮素沉积处理下的氮矿化酶活性变化不一致(图1)。与WN处理（不加氮肥）相比，随着氮素沉降量的增加，土壤中的脲酶和蛋白酶活性均呈下降趋势，其中MN处理（中氮）处理的脲酶活性显著降低(P0.05)，降低了39.58%。此外，LN、MN和HN处理的蛋白酶活性均显著低于WN处理(P0.05)，分别降低了76%、84%和56%。但氮沉降对L-天冬酰胺酶和L-谷氨酰胺酶活性无显著影响。Pearson相关分析发现，蛋白酶活性与土壤NO3--N和AP呈显著正相关，谷氨酰酶活力与TK呈显著负相关。
图1.氮沉降对红松人工林氮矿化酶活性的影响
03
土壤微生物多样性与群落结构
对原始数据进行质控后得到细菌有效序列,条，真菌有效序列,条。通过绘制稀释曲线(图S1)，确定各处理的测序量均已达到饱和，测序深度完全满足测试要求。根据97%的序列相似性阈值对质控后的有效序列进行OTU聚类，结果如图2所示。在四个处理中，4个分组中，细菌共有OTU数为个(图2A)，真菌为76个(图2B)。
图2.四种氮沉积处理的OTU数
根据OTU分类地位鉴定的结果，各处理组细菌在门水平上的相对丰度分别为变形菌门(30.0-46.0%)、酸杆菌门(22.8%-31.9%)、绿弯菌门(4.3-14.3%)、疣微菌门(2.3-19.6%)、放线菌门(4.8-8.7%)、芽单胞菌门(2.8-5.3%)、Rokubacteria(1.4-4.2%）。
各处理组真菌相对丰度分别:担子菌门(12.5-80%)、子囊菌门(7.9-62.4%)、Mortierella(2.0-26.9%)、隐真菌门(0.5-5.3%)和未鉴定真菌(0.3-6.9%)，占真菌总丰度的90.6%。(S2B)。上述5个门的相对丰度如图3B所示。担子菌相对丰度随氮沉降量的增加呈先下降后上升的趋势，且MN和LN处理间差异显著。与WN处理相比，LN处理的担子菌平均相对丰度提高了85.98%，而子囊菌、Mortierella和隐真菌门的平均相对丰度分别降低了35.78%、29.98%和19.37%。
图3.红松人工林土壤微生物相对丰度
04
不同处理关键微生物类群的筛选
采用Lefse分析和LDA分析相结合的方法研究了氮沉降对类群(从门到属)的影响。结果表明，细菌群落中有7个类群区分了4个处理，其中LDA得分大于2(图7A)。在属水平上，共检测到6个分支，包括来自WN的Ramlibacter和来自MN的Serratia,Tardiphaga,Massilia,Bdellovibrio和Metanome。只有HN处理具有Berkelbacteria，可作为红松人工林土壤细菌对高氮沉降响应的指示类群。在真菌群落中，只有一个真菌分类群区分了四个处理(图7B)，LDA得分大于4。只有HN处理具有多孔菌目，可作为红松人工林土壤真菌对氮沉降响应的指示类群。根据FUNGuild功能预测，多孔菌目是一种典型的木腐菌，与本研究中的四种矿化酶没有显著相关性。因此，腐生真菌丰度的变化是由氮沉降增加引起的，并不影响土壤氮素矿化。
图7.红松人工林中不同处理之间的分类学差异
05
土壤微生物群落的PLS-DA分析
对于细菌群落(图8A)，X轴将LN和MN处理分开，而Y轴将不同的处理与对照分开。从分离距离来看，LN和MN对细菌群落的影响大于HN处理。通过计算各分类群的VIP值，发现变形杆菌中的Tardiphaga(VIP1=2.38，VIP2=1.94)是对处理间差异贡献最大的细菌属。
对于真菌群落(图8B)，X轴将不同处理与对照分开，Y轴的结果与X轴的结果相似，MN的群落结构更接近于HN的群落结构。计算各分类群的VIP值表明，子囊菌中的Taeniolella(VIP1=2.09，VIP2=1.63)是对处理间差异贡献最大的真菌属。
图8.不同处理间微生物群落的PLS-DA分析
06
冗余分析（RDA）
对差异显著的20个细菌属和20个真菌属进行了土壤因子的冗余分析，结果如图9所示。图9a中的双序列RDA图显示，土壤因子可解释细菌群落总变异的54.57%，RDA1可解释总变异的29.03%，RDA2可解释总变异的25.54%，RDA1可解释总变异的29.03%，RDA2可解释总变异的25.54%。图9B所示的双序列RDA图表明，土壤因子可以解释真菌群落总变异的58.55%，RDA1总变异占32.58%，RDA2解释总变异的25.97%。对不同处理下土壤化学因子和土壤细菌、真菌群落结构的Mantel检验分析表明，土壤细菌群落结构的变化与任何土壤因子均无显著相关性，真菌群落结构的变化仅与土壤NH4+-N含量显著相关。
图9.红松人工林土壤微生物与环境因子冗余度分析
本研究的测序和部分分析工作由武汉菲沙基因信息有限公司完成。
总结
本研究结果表明，在全球氮沉降量增加的背景下，高氮沉降量(80kgNha?1year?1)并未导致东北红松人工林土壤酸化，但显著影响了土壤中有机质、铵氮和硝态氮的含量。氨态氮含量是引起红松人工林土壤真菌群落结构变化的关键因素。氮沉降量的增加抑制了脲酶和蛋白酶的活性，随着未来氮沉降量的增加，红松人工林土壤细菌丰富度可能会增加，真菌的丰富度和多样性可能会降低。
氮沉降量的增加对细菌和真菌群落结构产生了显著影响。Tardiphaga是对不同处理间细菌群落结构差异贡献最大的一个重要属，Taeniolella对真菌群落结构的贡献也最大。Berkelbacteria和Polyporales可作为红松人工林土壤细菌和真菌群落在氮沉降增加条件下的指示类群。
本研究的测序和部分分析工作由武汉菲沙基因信息有限公司完成。
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参考文献：
HeW,ZhangM,JinG,etal.EffectsofNitrogenDepositiononNitrogen-MineralizingEnzymeActivityandSoilMicrobialCommunityStructureinaKoreanPinePlantation[J].MicrobialEcology,:1-15.
