报告人：曹杰
今天由我来介绍中山大学燕窝团队在燕窝唾液酸相关研究。
一、研究背景
燕窝（EBN）是指雨燕科（Apodidae）金丝燕属（Aerodramus）和侏金丝燕属（Collocalia）的部分金丝燕在繁殖期间，用唾液腺分泌物筑成的供繁育幼燕所需的巢窝，主要分布在东南亚诸国。
燕窝中的主要成分包括蛋白质、碳水化合物、水分、灰分以及脂肪。其中脂肪含量很低，通常不到0.5%，是真正的低脂食品。燕窝中还有大量的蛋白质，检测到20种氨基酸，但没有检出羟脯氨酸和肌氨酸。这说明燕窝中没有胶原蛋白。燕窝自古以来就被当作高档珍羞食品以供豪门饮食，红楼梦和金瓶梅等众多古书中均记载了燕窝的食用方法以及药理作用。现代药理研究也证明了燕窝具有抗流感病毒、免疫调节、提高智力与增强记忆力、改善神经退行性疾病、促进细胞分裂等多种作用，这也是燕窝深受广大消费者喜爱的原因之一。提到燕窝的功效，首先想到的就是唾液酸，唾液酸的化学名称为N-乙酰神经氨酸，它广泛存在于鸡蛋、牛奶以及各种乳制品中，它可以以游离、低聚糖结合、糖脂结合或糖蛋白结合形式存在。唾液酸具有提高学习及记忆能力、改善神经性疾病、抗流感病毒、增强免疫力等功效，这与燕窝的药理作用也是相呼应。因此，对燕窝中的唾液酸进行研究是必要且重要的。
N-乙酰神经氨酸
二、燕窝中唾液酸的含量测定以及唾液酸形态变化的研究
唾液酸常用检测方法分为分光光度法、色谱法以及ELISA法，其中以色谱法中的HPLC法常用，因此，我们采用HPLC法对燕窝中唾液酸的含量进行测定。
首先是溶液的配制备：取约0.1g燕窝粉末，加入1%磷酸溶液酸解后在℃下水浴加热，期间不时振摇，10min后取出，冷却至室温。以0.22μm微孔滤膜过滤，即得样品溶液。并取适量唾液酸对照品配制成对照品溶液。
配制不同浓度梯度的唾液酸对照品溶液，用HPLC定量测定绘制标准曲线，以标准曲线计算燕窝中唾液酸的含量。
我们一共测定了38批不同产地、不同筑巢环境、不同颜色燕窝中唾液酸的含量，我们发现38批样品的唾液酸含量均在7.46%-11.33%之间，并且不同产地、不同颜色。不同筑巢环境的燕窝中唾液酸含量均无显著性差异。
接下来，我们采用了相同的测定方法研究了炖煮燕窝中唾液酸形态的变化。将燕窝加水浸泡2h后炖煮，得到燕窝炖煮物，利用三氟乙酸分级沉淀蛋白，离心后上清液加1.5%磷酸处理为游离与低聚糖结合唾液酸，沉淀加1.5%磷酸处理后为蛋白结合唾液酸，分别测定其含量。
在此基础上，研究了炖煮温度、炖煮时间以及料液比对燕窝炖煮物中唾液酸存在状态的影响。结果表明升高炖煮温度、延长炖煮时间以及增加料液比都可以使更多蛋白结合的唾液酸解离出来，使游离唾液酸含量增加。有研究报道，唾液酸的活性与其结合状态有关，因此根据该实验结果，可根据不同人群的需要开发具有某种特定结合状态的唾液酸产品。
考虑到水提法耗时长、效率低，我们紧接着优化了酶法提取燕窝游离与低聚糖结合唾液酸的工艺。将燕窝加入一定的水和酶进行水浴，得到燕窝酶解物，采用三氟乙酸分级沉淀蛋白，将上清液合并加入1.5%磷酸即得游离与低聚糖结合的唾液酸样品溶液。在此基础上，一共考察了9种蛋白酶的酶解效果，最终得出碱性蛋白酶酶解后的游离与低聚糖结合的唾液酸含量最多，因此选择碱性蛋白酶作进一步研究。
我们考察了酶解温度、料液比、加酶量、pH、酶解时间对游离与低聚糖结合唾液酸得率的影响，所得结果如下图所示。结果表明加酶量、PH、酶解温度这三个因素对游离与低聚糖结合唾液酸得率影响较大。因此，以这三个因素为自变量，游离与低聚糖结合唾液酸得率为因变量，利用Design8.0设计响应面实验。
响应面设计表以及响应面结果如下图所示。对响应面回归方程进行分析可知P0.05,说明该模型拟合度较高，可以通过该模型确定燕窝中游离与低聚糖结合唾液酸提取的最佳工艺。分析结果可知三个因素对得率影响的强弱顺序为：pH酶解温度加酶量。软件分析得到的最佳工艺参数：加酶量.82U/g、溶液pH为10.68、酶解温度59.79℃，在此条件下，燕窝中游离与低聚糖结合唾液酸得率的预测值为10.42%。调整酶解工艺为加酶量U/g，pH值为11，酶解温度为60℃，进行3次验证试验，得到游离与低聚糖结合唾液酸得率平均值为10.35%，与预测值接近，说明该模型拟合良好。该工艺显著提高了燕窝中游离与低聚糖结合的唾液酸含量。研究发现，自制的唾液酸游离样品对大鼠的学习记忆能力增强效果强于唾液酸标准品和蛋白结合唾液酸样品。因此，下一步可自制唾液酸样品并对其活性进行验证。
本文摘自第三届博士谈燕窝学术交流会大会报告“燕窝中唾液酸的相关研究及功能产品的开发”部分内容。
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博士谈燕窝中山大学基础医学博士后————————广州中医药大学医学博士扫描