大家好！今天跟大家分享一篇近期发表在NatureBiomedicalEngineering的文章，文章题目为“SimplifiedCas13-basedassaysforthefastidentificationofSARS-CoV-2anditsvariants”，通讯作者是来自普林斯顿大学分子生物学系的CameronMyhrvold教授。
背景介绍
SARS-CoV-2的广泛传播和突变需要更快速的核酸诊断。然而COVID-19诊断的金标准（RT-qPCR）需要专门的设备和一定的专业知识，很少在实验室之外使用，另外检测基础设施不足，加上试剂短缺和检测需求高，导致RT-qPCR的样本应答时间变慢。横向流抗原捕获检测和带有视觉读数的等温核酸诊断是实验室以外SARS-CoV-2检测的替代方法，但其中等灵敏度可能导致潜在阳性样本的漏检。等温核酸扩增方法，如环介导等温扩增（LAMP）比抗原捕获检测更灵敏，然而，这些设备往往过于昂贵，而且难以覆盖全人口检测的需要，这限制了它们在频繁和广泛的测试中的应用。
CRISPR-Dx是一种将等温核酸扩增方法（通常是LAMP或重组酶聚合酶扩增（RPA））与RNA引导的CRISPR-Cas核酸酶（通常是Cas12或Cas13）相结合的方法，可以用于病原体检测。到目前为止，只有少数CRISPR-Dx被开发用于识别各种SARS-CoV-2变体中存在的单个或多个核苷酸替换，但这些测试包括多个液体处理步骤或依赖于定制的设备，均不适用于即时检测。开发无设备和用户友好的CRISPR-Dx检测方法来区分SARS-CoV-2突变体，将解决COVID-19诊断中的需求问题。在这里，研究者开发了一种快速、用户友好和可广泛开展的SHINEv.2技术用于检测临床样本中的SARS-CoV-2及其突变体。与RT-qPCR相比，其检测灵敏度为90.5%，特异性为%，并且可以区分多种变体。
图文解读
检测SARS-CoV-2S基因的
SHINE方法设计
作者在之前的研究中开发了SHINEv.1方法，可直接从临床样本中检测SARS-CoV-2。在本研究中，作者进一步探究了是否可以通过选择具有更活跃的RPA引物和crRNAs的目标位点来进一步增强SHINE的性能。使用ADAPT（一种以基因组学为基础的核酸诊断计算设计工具）在年2月前收集的,个SARS-CoV-2基因组中，筛选出了3个具有较高预测活性的RPA引物和3个crRNAs，其可用于检测SARS-CoV-2的S基因。通过测量Cas13在合成RNA目标上的切割活性来选择最具活性的crRNA，而不需要预先的扩增，并优化了RPA引物浓度以建立S基因分析。研究者进行了生物信息学分析，以确保crRNA和RPA引物序列在SARS-CoV-2基因组中高度保守。在分析的,个SARS-CoV-2基因组中，crRNA序列完全保守的占99.79%，RPA引物可扩增99.77%的基因组。与之前的分析相比，对S基因分析速度快1-2倍，灵敏度高10倍。
提高SHINEv.1的易用性
为了提高用户友好性，研究者开发了SHINEv.2，它结合了常温样品处理和冻干测试试剂，从而大大简化了试剂运输和储存，并降低了分析的总体复杂性。为使方法更有效，免提取样品处理必须使核酸酶和感染性的病毒颗粒失活，并且必须与检测方法相兼容，从而实现良好的检测性能。研究者研究了与等温核酸扩增方法兼容的FastAmp病毒与细胞裂解方案，期望该裂解剂与基于Cas13的检测方法兼容。研究评估了FastAmp裂解试剂在人工鼻腔样本中灭活RNases的能力，设计的样本包括10%（v/v）的健康鼻液。在处理之后，添加了RNaseAlert，它在RNase存在且具有活性时将发出荧光（图1a）。未经处理的样本含有高水平的RNases，并表现出强的荧光信号。添加5%RNase抑制剂的FastAmp裂解试剂可使人工鼻腔样本中的RNase活性降低85%以上（图1a）。
在测定了该裂解液的RNases灭活能力后，研究者测试了它对SARS-CoV-2病毒原液的灭活能力。使用基于菌斑的分析方法对两代后的活病毒数量进行量化（图1b）。将SARS-CoV-2与裂解液在室温下孵育至少5分钟不会产生明显的斑块，从而证实了该裂解液能够快速灭活病毒。然后，研究者测试了该裂解溶液与SHINE分析性能的兼容性。通过控制靶RNA浓度的同时，用不同比例的空白灭活样品输入（即用裂解液处理的人工鼻腔样品）补充这些SHINE反应来评估裂解试剂的抑制效果（图1c）。向SHINE中加入10%（v/v）的失活样品能够保持全部活性。较大的输入量会增加临床样本量，导致SHINE的灵敏性显著降低（图1c）。因此，该裂解方法与SHINE兼容，可以有效地灭活RNases和SARS-CoV-2病毒颗粒，是环境温度下快速且无设备样品处理的理想选择。
冻干处理可以通过避免冷链需求和延长保质期来促进CRISPR-Dx的即时运输和储存（图1d）。最初使用原始SHINE缓冲液进行冻干，导致冻干后样品活性大幅下降（图1e）。研究者从原始SHINE缓冲液中去除3.5%的PEG-和60mMKCl，或添加5%（w/v）蔗糖和mM甘露醇，均能适度提高SHINE方法在冻干后的活性。结合这些改良，尽管在较低的靶RNA浓度下最大荧光降低，SHINE在冻干后仍保持其检出限（图1e）。优化了冻干辅料和程序后，研究者进行了为期一个月的实验，以确定冻干的SHINE在不同温度下随时间的稳定性。在室温、4°C或?20°C下分别放置4、7、14、21和28天后，SHINE颗粒被重新水化，并按照全基因组合成RNA标准进行测试，SHINE颗粒在室温下保持完全活性超过1周，在4°C/?20°C条件下至少保持活性一个月（图1f）。
为了评估长期储存后的SHINEv.2性能，研究者在冻干5个月后进行了SHINEv.2试验。在含有一定SARS-CoV-2RNA浓度的溶液中检测三次，发现冻干SHINEv.2颗粒在储存5个月后的灵敏度未受影响。SHINEv.2大大减少了用户需要的动手时间和液体处理步骤，从SHINEv.1中的45分钟和20个移液步骤减少到10分钟以下、5个操作步骤。当与SHINEv.1对照测试时，发现两种方法的灵敏度和反应动力学在多个目标浓度下是等效的（图1g）。SHINEv.2使用基于平板的荧光读数或基于色度横向流的读数（图1g，h），在90分钟内检测到每微升copies（cpμl-1）。在生产和运输到另一个大陆六周后，SHINEv.2被证明可以使用纸芯片检测到cpμl-1的全基因组合成RNA标准品。
根据美国食品和药物管理局（FDA）发布的指南，横向流式的SHINEv.2分析LoD为cpμl-1（图1i），比最先进的抗原捕获试验低一个数量级以上，与一些基于设备的等温核酸试验相当。
图1提高SHINE的易用性和可靠性
利用鼻咽拭子样本
评价SHINEv.2的临床性能
研究者使用美国疾病控制和预防中心（CDC）推荐的SARS-CoV-2RT-qPCR方法作为金标准参考测试，评估了SHINEv.2在未提取的鼻咽拭子样本上的临床性能。对72份来自SARS-CoV-2阳性和阴性患者的鼻咽拭子样本进行了同时检测。SHINEv.2在42个RT-qPCR阳性样本中的38个样本中检测到SARS-CoV-2RNA（90.5%灵敏度），而在RT-qPCR阴性样本中没有检测到SARS-CoV-2RNA（%特异性）（图2a，b）。接下来研究者将SHINEv.2的临床性能与两种广泛使用的FDA紧急使用授权的抗原捕获测试进行比较。在另外96个未提取的鼻咽拭子样本中进行了SHINEv.2测试，并与RT-qPCR、BinaxNow和CareStart测试并排进行（图2c）。SHINEv.2的灵敏度是任一种抗原捕获试验的50倍（图2d）。SHINEv.2适于检测中等病毒载量（25-30ct）的样本，从而能够识别抗原捕获测试遗漏的潜在感染样本。值得注意的是，该样本集的病毒载量分布比一般人群中预期的低50-倍（病毒载量中值为~1.9×cpml-1），这有助于确定SHINEv2的临床LoD。SHINEv.2、BinaxNow和CareStart都是高度特异的，在33个RT-qPCR阴性样本中，均没有假阳性结果(%特异性)，这与先前报道的这些抗原捕获试验的结果一致。CRISPR-Dx因为扩增过程中的RPA引物和基于Cas13的检测过程中的crRNA提供了两层特异性。因此，SHINEv.2对患者样本的灵敏度和特异性以及其用户友好性对于社区测试特别有价值。
图2SHINEv.2在临床样本中的性能
SHINEv.2对SARS-CoV-2VOCs
检测的设计与测试
研究者利用SHINEv.2对SARS-CoV-2的五种VOCs（VariantsofConcern）进行分析。首先设计了一组在参考RNA基因组上与包含给定突变的RNA基因组相比具有不同活性的crRNAs，反之亦然（图3a）。对于AlphaVOC，设计了一组10个crRNA来检测69/70的缺失，成功地检测到合成RNA目标中的69/70缺失（图3b）。并且设计更多的分析方法来鉴定Beta和GammaVOCs。这些变异体在S基因的第位氨基酸（即Beta基因的KN和Gamma基因的KT）上包含明显的单核苷酸多态（SNPs），这些SNPs都不存在于参考基因组或AlphaVOC中。使用计算设计技术来产生crRNAs，该crRNAs最大化预测的第位的SNP区分，并使用ADAPT34来帮助设计这些crRNAs的RPA引物。经过测试优化后，证明了检测方法可以高精度地区分三种基因类型（图3c）。当在合成RNA目标上进行测试时，每个试验在其首选目标上的活性（即更高的荧光）至少是非首选目标上的3倍（图3c）。测试了它们在全基因组合成RNA标准和从SARS-CoV-2病毒中提取的RNA上的性能。在每种情况下，这些分析都正确地识别了它们各自的突变的存在或不存在（图3d）。对于AlphaVOC，衍生的crRNA的荧光信号比原始的crRNA高3倍以上，表明存在69/70缺失。相反，原始crRNA的荧光信号比参考菌株以及Beta和GammaVOCs高1.25-3.5倍，这证实了这些病例中没有S基因缺失。同样，通过检测，每个变体的基因都被正确地鉴定出来，基于这一点，crRNA显示了最高的活性（图3d）。例如，对于GammaVOC，衍生的TcrRNA导致了最高的荧光水平，从而正确地识别了KTSNP在该变体中的存在。通过酶标仪中的基于荧光的读数，这些VOC检测可以为初级医疗机构带来快速的VOC识别能力。
研究者评估了从20个鼻咽拭子样本中提取的RNA采用69/70分析的临床表现。SHINEv.2正确地识别了AlphaVOC阳性样本（Ct值为23-29）中69/70缺失的存在，这表明在样本E6至E10（图3e）中衍生的crRNA具有更高的荧光。此外，69/70缺失分析显示出极好的特异性（%），检测到所有RT-qPCR阳性样本和RT-qPCR阴性样本。
SHINEv.2是一种灵活的技术，可以快速适应检测新的病毒变体。研究者设计了一套crRNA和RPA引物，用于检测DeltaVOC中存在的和-突变，并评估它们在全基因组合成RNA标准上的表现。这两种试验都成功地检测到合成RNA目标中的突变，灵敏度和特异性都很高。特别是-检测显示了极好的特异性。原始和衍生的crRNA都以高精度检测到各自的目标。接下来，作者检查了这些检测方法与冷冻干燥和常温样品处理的兼容性。这些SHINEv.2检测在全基因组合成RNA标准上表现出极好的特异性，清楚地将DeltaVOC与参考菌株以及其他VOCs区分开来。根据每对crRNA的不同荧光活性，和-检测正确地识别了每个被测变异体的基因型。此外，两种SHINEv.2分析都使用基于侧向流动的比色读数正确地识别了每个突变是否存在。
鉴于Omicron的快速传播，寻求快速建立一种Omicron特异的SHINEv.2检测方法。针对OmicronVOC中存在的-突变设计了一组crRNAs和RPA引物，优化了Omicron特异性检测方法，并在未提取的临床样本上评估了其性能（图3f）。当对12个未提取的鼻咽拭子样本进行测试时，Omicron特异性SHINEv.2检测正确地识别了所有OmicronVOC阳性样本中-突变的存在，如包含提取的crRNA的纸条中的深色条带所示（图3f）。此外，Omicron特异性SHINEv.2试验在所有Omicron阴性样本中检测到-突变缺失，并表现出极好的特异性（%），检测到所有RT-qPCR阳性样本和RT-qPCR阴性样本（图3f）。
图3SHINEv.2对SARS-CoV-2VOCs检测的设计与测试
面向家庭的SHINEv.2测试
SHINEv.2增加了基于CRISPR的SARS-CoV-2诊断的可行性，并能够在实验室环境之外进行VOC识别。然而，SHINEv.2需要进一步改进才能应用于多种环境。例如，合并内部控制或者进一步简化检测读数，可以极大地扩展SHINEv.2的使用范围，并使其能够在家庭环境中使用。
核酸诊断测试通常需要内部控制作为监管批准过程的一部分，使用具有正交识别和切割特性的Cas酶可以从单个反应中检测多个目标。Cas12是一种检测和切割DNA的Cas酶，可用作Cas13的正交酶。因此，设计并开发了一种基于Cas12的人类RNaseP检测方法，作为SHINEv.2的内部对照。在优化了RPA引物浓度后，RNaseP可以检测到合成DNAcpμl-1（基于荧光的读数）和0cpμl-1（基于纸张的格式）。接下来，测试了这种基于Cas12的检测方法是否与FastAmp裂解溶液和冻干兼容。在这种格式中，基于Cas12的RNaseP检测使用基于荧光或基于横向流动的读数检测到低至cpμl-1的合成DNA靶标，这支持其作为SHINEv.2内部对照的潜在用途，如图4a和4b。结果还证明了使用环境温度裂解溶液进行基于Cas13和Cas12的诊断。因此，研究者试图确定基于Cas12的RNaseP测定与基于Cas13的S基因测定的兼容性，并评估这种双链测定在合成核酸靶标上的性能。双工SHINEv.2检测成功检测到两个目标，每个目标的LoD为?cpμl-1。此外，这些结果证实了对SHINEv.2的改进适用于其他系统，包括基于Cas12的检测和可能的其他CRISPR-Dx。
SHINEv.2的用户友好性可以通过进一步简化分析来提高。CRISPR-Dx的基于横向流动的读数是按需实施的首选选项，它需要在执行检测反应后添加缓冲液，增加了液体处理步骤并增加了风险样品污染。将纸条直接插入SHINEv.2中反应将大大降低这种风险。然而，未稀释的SHINEv.2反应会阻止纳米颗粒流过纸条，导致测试失败。研究者推断高分子量PEG可能是造成流动不足的原因，试图确定具有不同分子量的PEG组合，该组合能够在保持SHINEv.2活性的同时实现流动。在没有RNA靶标的情况下，降低SHINEv.2反应中PEG的浓度和分子量有助于纳米颗粒流过纸条。然而，当降低反应中PEG-的浓度时，SHINEv.2的灵敏度显著降低。使用0.35%PEG-和3.5%PEG-0的组合，未稀释的SHINEv.2能够在不降低性能的情况下检测SARS-CoV-2RNA，同时保持流动，如图4c所示。
此外，SHINEv.2由于其最低的加热要求，可以在没有设备的情况下运行。SHINE在37°C下的单个90分钟孵育步骤可以通过低成本和节能的加热块轻松维护。使用大约37°C的体温可以为完全无设备的SHINEv.2测试提供替代方案。如图4d所示，事实上，SHINEv.2的腋下孵育成功地检测到cpμl-1的SARS-CoV-2RNA，并且与在加热块中孵育的SHINEv.2具有相似的效率。然后，试图将体热孵化与液体处理步骤的消除相结合，以开发进一步简化的SHINEv.2技术，实现完全无需设备的基于CRISPR的POC诊断。根据FDA的指导，确定简化和无设备SHINEv.2的分析LoD为cpμl-1（19/20重复为阳性，图4e）。这与在基于仪器的SHINEv.2中获得LoD相同，仍然低于其他检测SARS-CoV-2的无设备方法。
研究者使用基于板的荧光读数和基于比色纸的读数检查了SHINEv.2在25°C下的性能。SHINEv.2能够在25°C下使用读板器检测SARS-CoV-2RNA，如图4f所示,但速度和灵敏度低于37°C条件下的检测。灵敏度下降是由于RPA在较低温度下的性能下降造成的，因为单独的Cas13检测在25°C和37°C下表现良好。总的来说，这些改进增加了SHINEv.2的易用性，并使其几乎可以在任何情况下使用。
图4增加SHINEv.2的易用性
结论
SHINEv.2是一种基于CRISPR-Dx的检测技术，通过简单的工作流程从未提取的样本中进行SARS-CoV-2RNA检测和变体识别。先前开发的CRISPR-Dx通常过于复杂或需要冷链和辅助设备，SHINEv.2解决了这些限制。使用无设备和环境温度样品裂解方法进一步提高了分析的用户友好性。SHINEv.2只需要与抗原捕获测试一样少的用户步骤，同时将灵敏度提高了50倍。重要的是，在RNA水平高于cpμl-1的样本中，SHINEv.2与RT-qPCR（SARS-CoV-2诊断的金标准）完美一致。SHINEv.2可以准确识别Alpha、Beta、Gamma、Delta和OmicronSARS-CoV-2VOC中的几个进化枝特异性突变，并且可以快速适应当前和未来出现的病毒变体以及其他病毒爆发。在人群层面，SHINEv.2可用于优先在受影响严重的社区进行测试和疫苗推广，或选择样本子集以进行进一步的病毒测序。SHINEv.2还可以帮助临床医生为重症COVID-19患者选择正确的治疗方法。
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