正交氨酰基-tRNA合成酶(AARSs)的定向进化能够实现非标准氨基酸(ncAAs)在蛋白质中的位点特异性插入。传统进化技术通常产生活性和选择性大大降低的AARS。因此设计了噬菌体辅助连续进化（PACE）选择，通过数百代的进化快速产生高活性和选择性的正交AARS。嵌合体甲烷八叠球菌吡咯赖氨酰tRNA合成酶（PylRS）的噬菌体辅助连续进化（PACE）的产酶效率比原酶的催化效率提高了45倍。48小时内同时进行正选和负选噬菌体辅助连续进化（PACE），大大提高了混杂的詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶变体对对碘-L-苯丙氨酸位点特异性结合的选择性。
1、通过将tRNA氨酰化与基因III（编码噬菌体感染所需的丝状噬菌体蛋白pIII）的表达联系起来，可以建立AARS活性的PACE选择。通过它们正交的琥珀抑制基因tRNA的氨酰化将通过琥珀抑制诱导pIII产生。第一种策略，通过琥珀抑制T7RNA聚合酶（T7RNAP）基因中的提前终止密码子，翻译全长T7RNAP，从而从上游T7启动子转录基因III。第二种更严格的策略，琥珀抑制基因III中的过早终止密码子可导致全长pIII的直接翻译。
第一种选择策略，我们在T7RNAP中鉴定了在突变多种氨基酸时不会抑制酶活性的残基，并确定了T7RNAP基因中所需的琥珀密码子数量，以使聚合酶的全长翻译完全依赖于正交翻译。在T7RNAP基因的Ser12、Ser、Tyr、Tyr和Ser位置安装了琥珀突变。使用先前进化的MjTyrRS突变体（p-NFRS）在这些位点的组合处安装对硝基-L-苯丙氨酸（p-NF）显示，T7RNAP转录激活至少需要两个琥珀终止密码子，以完全依赖AARS和ncAA底物。第二种选择策略，即基于直接琥珀抑制基因III中的过早终止密码子，在基因III的Pro29、Pro83、Thr或Tyr位置进行琥珀突变。结果发现在pIII中突变的每一个位置都允许ncAA结合，并且pIII编码序列中存在一个过早终止密码子足以使噬菌体增殖依赖于来自SP-p-NFR或SP-CHPYLR的AARS活性。
总之，这些进展确定了T7RNAP和pIII中耐受一系列氨基酸侧链的位置，从而建立了两种策略，通过琥珀抑制T7RNAP或基因III中的过早终止密码子，将AARS活性与噬菌体感染性联系起来。
2、AARS阴性选择的开发和验证尽管阳性选择PACE大大提高了PylRS的活性，但AARS进化为识别非同源底物需要负选，以使对内源氨基酸的活性降至最低。因此开发了将tRNA氨酰化与噬菌体增殖抑制联系起来的PACE负选。由于pIII-neg可以毒化新兴噬菌体的传染性使得具有不良活性的变体无法有效繁殖。SP-p-NFRS的模拟PACE负选证实了针对AARS活性的阴性选择。
3、连续进化以提高氨基酸选择性研究通过发展p-NFRS选择性地安装p-IF，耦合的PACE正负选择产生高度特异性AARS的能力。使用单轮非连续反选择从进化库中分离出对PACE中的p-IF具有优先活性的SP。结果表明，PACE可以在48小时内从多特异性变体快速进化出高度选择性的AARS，而无需文库克隆。该方法还消除了重复进行质粒分离和重新转化的需要，并且可以同时连续地进行正选和负选，从而大大增加了对AARS进化的总次数。
总结：这项研究建立了进行AARS连续定向进化的能力，与逐步实验室进化技术相比，大大增加了在实际时间内可能发生的进化代数。使用PACE，我们开发了PylRS和MjTyrRS变体，具有大大提高的活性和特异性，而无需克隆诱变的文库或一次只进行一轮耗时的选择。原文：Bryson,D.,Fan,C.,Guo,L.etal.Continuousdirectedevolutionofaminoacyl-tRNAsynthetases.NatChemBiol13,–().