凝乳酶是干酪制作过程中促使牛乳凝固的关键蛋白酶。随着乳制品行业干酪产量的日益增长，凝乳酶的需求量不断增加，但是传统动物来源的凝乳酶价格昂贵，且由于宗教或饮食原因，其应用受到一定程度限制。获得天然高效的新型凝乳酶成为干酪产业新的挑战。微生物凝乳酶具有来源广、易于获得、成本低等优点，是当前凝乳酶研发的热点。
干酪成熟过程中伴随着蛋白水解作用导致小肽和游离氨基酸的不断积累，可产生香气化合物和生物活性因子，对干酪的风味、功能和质地都有影响。不同来源微生物凝乳酶的蛋白水解特性不同，导致干酪成熟过程中蛋白水解程度的差异，对干酪品质产生不同的影响。近年来微生物凝乳酶在切达干酪中的应用侧重于研究干酪成熟过程中的蛋白水解对风味及感官特性的影响，而对于成熟期干酪因蛋白降解导致的干酪生物活性变化的研究不多。
北京食品营养与人类健康高精尖创新中心、北京市食品添加剂工程技术研究中心和北京工商大学的赵笑、蔡淼和杨贞耐*等人探讨GSBa-1凝乳酶对切达干酪成熟过程中蛋白水解的作用及其与干酪生物活性之间的关系，通过控制微生物凝乳酶的蛋白水解改善切达干酪的生物活性，旨在进一步了解微生物凝乳酶对干酪成熟特性和生物活性的影响及其作用机理。1解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶作用下凝乳过程的流变学特性
前期研究表明GSBa-1凝乳酶为中性蛋白酶，为探究该凝乳酶作用下的凝乳特性及蛋白水解变化，使其更好地应用于干酪生产，选择商业凝乳酶和商业芽孢杆菌中性蛋白酶对比GSBa-1凝乳酶在牛乳凝固过程中的流变学特性。结果显示，加入GSBa-1凝乳酶的牛乳在整个凝乳过程中的黏弹性变化与商业凝乳酶更为接近，黏性显著高于中性蛋白酶形成的凝乳。氯化钙的加入使GSBa-1凝乳酶和商业凝乳酶的凝乳位点向前移动，加快凝乳，缩短凝乳时间，提高凝乳后的弹性和黏性。加入中性蛋白酶的牛乳快速凝乳后凝乳结构又迅速瓦解，整个过程中的黏性都很低，且氯化钙的加入使其弹性也迅速降低，表明该酶由于强烈的蛋白水解作用，不适用于干酪加工。而GSBa-1凝乳酶与商业芽孢杆菌中性蛋白酶不同，前者表现出更好的凝乳特性和较低的蛋白水解特性，可用作凝乳酶代替或者部分代替商业凝乳酶用于切达干酪的制作。
2切达干酪的理化指标分析
2.1干酪基本理化指标结果显示，不同实验组成品切达干酪的干酪得率、总蛋白含量、脂肪含量以及氯化钠含量之间无显著差异（P＞0.05）。说明GSBa-1凝乳酶对切达干酪的主要组成成分没有明显影响。
2.2切达干酪成熟过程中的pH值、水分及微生物变化由图2A可知，整个干酪成熟过程中，3组干酪的pH值呈现上升的趋势，pH值大小为干酪A＞干酪B＞干酪C。由于干酪制作过程中乳清排出时的pH值保持一致，干酪初始氯化钠含量没有明显差异，因此，干酪CpH值显著降低表明GSBa-1凝乳酶的蛋白水解作用可以使发酵剂的代谢活动增强，产酸能力增加。由图2B可知，干酪A和干酪B的水分含量有所升高，干酪C水分含量则明显升高，且显著高于干酪A和干酪B（P＜0.05），可能由于干酪C中GSBa-1凝乳酶的蛋白水解作用，使得干酪蛋白结构部分破坏，部分结合水转化为自由水，同时也影响了干酪的保水能力。切达干酪成熟过程中，乳酸乳球菌的生存环境发生变化，部分菌发生自溶，使得3组干酪的乳酸乳球菌数均逐渐下降，如图2C所示，干酪C中的乳酸乳球菌数由9.77（lg（CFU/g））显著下降至5.08（lg（CFU/g）），干酪成熟4周后，干酪C的微生物乳酸乳球菌数迅速下降，显著低于干酪A，干酪B乳酸乳球菌含量则介于干酪A和干酪C之间。干酪C较高的水分及pH值的迅速降低使乳酸乳球菌的自溶率增加，乳酸菌含有胞外及包内多种蛋白酶，乳酸乳球菌的死亡，有助于胞内酶的释放。
3切达干酪成熟过程中的蛋白水解作用
3.1GSBa-1凝乳酶对切达干酪成熟过程中蛋白水解活性的影响
如图3所示，干酪成熟过程中，干酪A和干酪C的蛋白水解活力趋势相接近，在1周之内先分别上升至4.20U/g和3.33U/g，超过1周之后缓慢下降并趋于平稳。干酪C的蛋白水解活力则是在干酪成熟2周之内先上升至8.02U/g，后到成熟第12周逐渐下降至2.59U/g。干酪C的蛋白水解活力始终显著高于干酪A和干酪B。
为进一步探究GSBa-1凝乳酶作用下干酪蛋白的水解变化，将3组干酪不同成熟期的蛋白应用于SDSPAGE，结果如图4所示。干酪A0～12周成熟过程中蛋白条带变化清晰，副κ-酪蛋白由商业凝乳酶切断κ-酪蛋白的Phe～Met之间的肽键而产生，其蛋白条带在10～15kDa之间，存在于整个成熟过程，且未发生任何变化。α-酪蛋白条带逐渐变窄，主要生成了位于下方的两条清晰可见的蛋白条带，而β-酪蛋白的变化不明显。干酪B中蛋白条带的变化与蛋白A接近。干酪C则在成熟过程中产生了很多模糊的蛋白条带，尤其在成熟后的第12周，在小于10kDa的蛋白下方，生成了一些小分子质量的蛋白，表明干酪C成熟过程中在GSBa-1凝乳酶的作用下，更多的蛋白位点被切断，酪蛋白被水解为小肽和氨基酸，使得干酪C和其他两组干酪蛋白条带有显著差别。
3.2pH4.6可溶性氮及12%TCA可溶性氮的变化切达干酪成熟过程中pH4.6可溶性氮（图5A）及12%TCA可溶性氮（图5B）的变化，分别以占总氮质量百分比表示。pH4.6可溶性氮可作为蛋白质水解程度的指标，3组干酪中的pH4.6可溶性氮在成熟过程中均显著增加后趋于平缓，干酪A、干酪B和干酪C在第12周的pH4.6可溶性氮质量分数分别为9.32%、11.28%和13.32%。该结果表明解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶对切达干酪的蛋白水解程度显著高于商业凝乳酶。
3组干酪中12%TCA可溶性氮在12周成熟过程中均呈上升趋势，干酪A由1.91%上升至4.06%，干酪B由2.66%上升至4.95%，干酪C由3.22%上升至8.31%，且在整个成熟过程中存在显著差异（P＜0.05）。该结果表明解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶的对干酪的蛋白水解作用增强了乳酸菌的代谢活动，使乳酸菌蛋白酶和肽酶活性增加，进而产生更多的小分子肽和游离氨基酸。
4切达干酪成熟过程中生物活性的变化
如图6所示，干酪成熟过程中金属离子螯合能力随成熟时间的延长缓慢增加，干酪C的钙离子、锌离子螯合能力在4～12周的成熟过程中均高于干酪A和干酪B，且干酪B的螯合能力介于干酪A和干酪C之间。尤其在干酪成熟的第12周，干酪C和干酪B的钙离子螯合能力高达57.76%和53.11%，而干酪A的钙离子螯合能力仅为49.88%。相比于干酪的钙离子螯合能力，其锌离子螯合能力则较低，干酪C和干酪B的锌离子螯合能力最高为17.70%和15.19%，而干酪A的锌离子螯合能力仅为9.71%。
随着干酪成熟时间的延长，α-葡萄糖苷酶抑制率逐渐上升至60%以上（图7A），但3组干酪之间在整个成熟过程中差异不明显。随着成熟时间的延长，α-淀粉酶抑制率呈下降趋势（图7B），但相比于干酪A，干酪B和干酪C的α-淀粉酶抑制率下降速率减慢，在成熟期12周时的α-淀粉酶抑制率分别为40.64%、46.50%和46.04%，但不同组干酪间没有显著差异（P＞0.05）。降血糖作用可能主要与发酵剂乳酸菌水解酪蛋白产生的小分子肽有关，GSBa-1凝乳酶会不影响干酪的降血糖活性。
在成熟过程中，干酪对于DPPH自由基的清除能力（图8A）先增加再降低然后趋于平缓，说明部分抗氧化肽可在干酪成熟过程中被进一步水解。而对于ABTS阳离子自由基的清除能力（图8B）则一直上升至成熟的第12周，且干酪对于ABTS阳离子自由基的清除能力更为明显。对于两种自由基的清除率，干酪C显著高于干酪A和干酪B，尤其是在干酪成熟的第4～8周，DPPH自由基清除率最高为16.49%，ABTS阳离子自由基清除率最高为78.38%。肽的功能与其结构相关，且小于3kDa的肽段比3～5kDa的肽段具有更高的生物活性。不同凝乳酶的使用，导致干酪成熟过程中蛋白水解的变化，释放出不同结构的肽段，因此，不同组干酪的功能性有明显差异。
结论
与商业凝乳酶制作的切达干酪相比，解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶制作的切达干酪在成熟过程中的pH值和微生物含量显著较低，水分含量显著较高。由于GSBa-1凝乳酶具有相对较高的蛋白水解活力，使得其制作的切达干酪pH4.6可溶性氮和12%TCA可溶性氮含量显著较高，在成熟过程中生成了较多的小分子肽。体外生物活性实验结果表明，GSBa-1凝乳酶可以提高切达干酪成熟过程中的钙离子、锌离子螯合能力和抗氧化能力，但对干酪降血糖作用的影响不大。因此，在满足切达干酪其他性质的同时，为了提高切达干酪的生物活性，可使用解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶替代或者部分替代商业凝乳酶制作切达干酪。
本文《解淀粉芽孢杆菌GSBa-1凝乳酶对切达干酪成熟过程中蛋白水解及生物活性的影响》来源于《食品科学》年41卷22期-页，作者：赵笑，蔡淼，杨智杰，罗天淇，陈超，曹永强，杨贞耐。DOI:10./spkx---。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
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