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生化反应和反应曲线

发布时间:2022-4-27 16:59:18   点击数:
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1:朗伯-比尔定律(以下简称L-B定律)

首先,生化仪的主要基本原理之一是朗伯-比尔定律,这个大家应该都听过名字,

有些人会对各种公式之类的头疼,不过入门的话,只要对一般的性质了解就行了,公式说明啥的完全可以不管啦。

朗伯-比尔定律实际上就是说:如果有一种物质有颜色,那颜色越深,吸光度就越高,物质的含量就越多。(而且两者成线性的正比,这样两者的关系就是一条直线,可以用来计算)

当然直线只在浓度不太高的时候成立,浓度太高就会不再是直线,不过对于我们普通生化试剂来说,这个方面的问题一般可以不考虑,大部分情况下一般达不到这个浓度。

其实就一句话:吸光度和物质浓度成线性关系!

2:生化反应的原理和方法

生化反应曲线如果看不懂,可以先从原理和最简单的反应开始入手,比如总蛋白:

先是反应原理:Cu2+(蓝色)+-CO-NH-(蛋白质的肽键)=络合物(紫色)

根据第1点里的说明,很明显紫色的深度(吸光度)和络合物的含量成正比,而络合物怎么来的?铜和蛋白反应来的。

只要铜离子足够,就能将所有的蛋白全部络合。所以络合物的浓度=蛋白质的浓度。

这个时候看一下一般的反应曲线:

我们能看出来,一开始(加完样本和R1之后)吸光度基本是稳定的一条水平线,

加入试剂开始反应后,颜色浓度(吸光度)开始上升,上升到一定程度后,颜色基本不再加深,说明反应完了。理论上可以认为待测的蛋白全部络合并显色。

根据上面看到的,一开始的吸光度是87,反应后的吸光度是,我们目前可以认为,样本中的蛋白质参加反应后,让吸光度升高了-87=。

这时候的吸光度,反映了有色物质(络合物)的浓度,

而络合物的浓度,又反映了待测物质的浓度(总蛋白),

这样就建立起了一个“吸光度-络合物浓度-总蛋白浓度”之间的关系。

且“吸光度-络合物浓度”根据L-B定律,成线性正比,

而“络合物浓度-总蛋白浓度”根据反应方程,两者浓度相同(总蛋白全部转变为络合物)。这样关系其实也就是:

“总蛋白浓度”=“络合物浓度”正比于“络合物吸光度”。

所以在反应后的吸光度上升程度和总蛋白的浓度成正比,上升的越多,总蛋白浓度越高。

我们计算时,也只需要最后的吸光度,至于上升过程中的曲线形态,其实在一定程度上可以不管,因为在原理方面,它的反应是将所有的待测物质转变为显色物质,只要能全部转变,不管反应的是快是慢,最终形成的吸光度结果都一样。

上面这种将待测物质全部转变为显色物质的反应,都是让反应进行的到终点的,所以这种方法的名字就叫“终点法”。

其主要特点就是:反应到终点,待测物质全部转变为显色物质,吸光度不再变化。

但还有些时候,待测物质浓度比较高,结果试剂耗完了(比如说蛋白浓度太高,把铜结合完了还有剩余的),这也到了终点,但这时的终点就不再是待测物质的终点了,因为蛋白还有剩的。

这种就是试剂耗尽,换句话来说,比如我知道现在试剂里铜离子浓度是Amol/l,最大显色程度是Abs。那如果检测的吸光度整体在以下,我都可以认为是反应的终点没问题,蛋白都消耗光了,如果接近或达到达到,我就可以认为反应不一定充分,也许是试剂消耗的差不多了,则结果可能并不准确。

这就是终点法中的吸光度限制:吸光度达到一定程度之后,仪器会出现警报,说明检测结果可能有异常。

3:另一类物质

上面就是一般的代谢物等生化项目出结果的过程,都是待测物质通过某些反应与显色物质的浓度挂上钩。但是人体内还有一类比较特殊的玩意儿:酶

我想大家应该都知道,酶是催化反应的,反应前和反应后又不变,那反应起来的话,无论你加了多少底物,理论上反应起来都可以耗光,底物耗光之后,显色物质的浓度都一样,没办法区分,那该怎么检测呢?

这时候人们发现,酶的量和催化效率有一定的关系,如果酶越多,单位时间内能催化反应的底物越多,也就是反应的速度越快。(当然这其实也和酶的活性有关,所以现在我们使用的单位一般是酶活度单位U/L,而不是和一般生化一样用g/L或mmol/L)

所以这时候,就是让酶催化一个显色反应,并产生显色物质,再通过生化仪检测显色物质生成的速度,看反应的过程有多快,反应的越快,对应的酶的活性就越高。

所以对应的反应曲线一般是这样的:

可以看到,在实际反应开始后,吸光度呈直线上升,而如果酶的浓度或活性越高,单位时间(检测范围)内的上升程度就越高,上升速度就越快。

这时候仪器就可以通过检测吸光度的变化速度来判断反应的速度,反应速度又与酶的活性成正比。也就是

“酶含量”正比于“反应速度”=“显色物质生成速度”

而和终点法的试剂耗尽相对的,如果酶的活性过高,让试剂里的底物在达到预设读点区间时就反应完生成显色物质了,那在正式读点的区间就会出现无法升高的吸光度横线,从而得出错误的结果。

不过因为酶催化的是底物,这种“速率法”里的“试剂耗尽”就被称为底物耗尽了。就像下面

上图就是酶活性过高,在加R2之后的预反应阶段内就把试剂反应完了,正式读点的时候是一条水平直线,结果反而是负数;

因为耗尽了所有的试剂,所以前面会有一个非常大的上升或下降幅度,如上图就从接近直接降到了近,吸光度下降程度接近(具体数值与仪器、试剂、参数设置均有关系)

据此某些厂家还提出了一个“读点提前”的计算方式,在这种情况下将读点区域和范围提前,用反应线性期的斜率进行结果计算。但因为设置和判断复杂,暂时用的人不多

4:结果的计算

大家还有没有发现,上面一直说的是各种“正比”之类的东西,吸光度之类的是光的强度,而总蛋白浓度是物质的量(g/L),虽然他们之间有关系,但这又不像1kg=g,光和物质量之间怎么换算呢?

这时候就轮到“标准品”上场了,标准品作为一个标准,它本身的待测物质的值是确定的,然后将标准品上机进行检测,得到标准品的吸光度:

而根据一般的L-B定律,浓度和吸光度的关系都是呈直线的,所以只要两个标准品,分别测一下吸光度,就能在“浓度-吸光度”的坐标系中确定两个点,并画出一条直线了。

之后做的所有普通标本,都可以在这条线上找到样本吸光度所对应的结果。这就是所谓的定标。定标得出的标准曲线是用于计算常规样本的结果的。

虽然L-B定律是线性的,但有些项目的反应程度不是线性的,像部分抗原抗体反应,浓度和反应程度的关系是曲线,那到时候就需要更多的点(和拟合方式有关,一般5-6个点),并用曲线来讲这些点连在一起。

仪器中常见的拟合方式有:

点到点拟合:每两个点之间用直线链接起来,一般多用于多个点拟合,就是一条折线

直线拟合:两点确定一条直线(两点)或用直线回归拟合(多个点)

四参数拟合:免疫类常用的曲线拟合方式,可以拟合的形状趋势较多,公式共有4个参数。

样条拟合(Spline):和点到点类似,不过点到点之间链接的不是直线,而是二次/三次曲线,并通过一定的算法将其平滑化(所以一般无法看到此种定标方式的定标参数,因为并不是一个方程连起来的)

5:反应方法:

实际上可以说本质上生化就这两种方法:终点法和速率法

至于生化仪中其他的像什么所谓的1点法,2点法,平均点法,平均速率法等等,都只是这两种原理的衍生方法而已,本质上没有区别。

一般生化仪常见的几种方法:

(终点法)1点法:(一般在反应完成后)选取一个点的吸光度数值作为终点吸光度,是基本方法之一,也用于有些不太适合扣空白扣除的项目(如部分血脂项目,血脂高时可能有浑浊吸光,反应后脂质消耗浊度下降,具体请依照说明书)

(终点法)2点法:在正式反应前(一般加过样本和R1)选择一点,反应完成后再选择一点,计算吸光度升高的程度。可以扣除部分试剂空白,样本空白等一系列影响因素,是一般情况下最常用的终点法。

(速率法)平均速率法:在正式反应时选择一个可靠的线性期区间,计算区间内的平均速度

(速率法)2点速率法:只选择开头和结尾的两点,用两点来计算速度的大小。

6:两种方法的对立和统一

上面说了终点法和速率法各自的特点,但是我们现在一般生化使用的都是全自动生化仪,而全自动生化仪的最大特点就是固定化和程序化。

这种情况下,你也许会发现:

如果选终点法,是读一个固定时间段内的吸光度变化

如果选速率法,是读一个固定时间段内的吸光度变化率

如果一个终点法的吸光度变化高,那它的速率肯定也快

如果一个速率法的吸光度变化快,那它的终点肯定也高

这时候,你看两者是不是很像?

所以有时候,你会看到某些实验室的仪器参数都设错了,但是他们可能还会说:“我们结果做的很好”“我们的结果很稳定”“我们通过了质评”……

这也很正常,就算有时候你误把两点终点设成了两点速率,一般也能得出结果,有时候两者也差不多。

那是不是意味着两者在仪器上没什么区别了?当然不是

两者在一开始的理念上差别很大,只是在全自动仪器的加持下有了一定的统一。

但因此,两者在用于计算时的数字就不一样,像终点法一般是直接用1到2个点的吸光度就可以计算的,而速率法(特别是平均速率法)则用于计算的点会多很多,还要算斜率,定标曲线就会和你用终点法算的不一样。

仪器针对这两种方式的报警提示一般也有不同,而且对于一般的终点法项目,如果反应曲线的形状不直,误选平均速率法会无法算出一个稳定的斜率,如果误选两点速率法,有可能结果会相对好一些。

而且方法选错的话,对于一些异常或特殊的标本,会让反应曲线特点和普通标本有差异,从而导致结果出现差异。

但不管仪器怎么算,对于每个项目的检测方式,自己心里应该清楚,最起码如果弄清了原理,在遇到异常曲线的时候,不至于完全一头雾水。

一个例子:异常的ALT-AST曲线

仪器出现异常报警如下:(Lin一般意味着监测的反应曲线有异常)

ALT曲线如下所示

AST曲线如下所示

(两项目情况类似,下面仅介绍ALT的情况)

初步看来,仅一开始有一个下弯的反应过程,在监测范围内的反应曲线形态基本良好

上图为直线区域放大(调节吸光度比例尺):

可以看到读点起始区域的线性异常(与后面的点不在同一条直线上)因此报警

也就是一开始的那部分是延续前面的弯曲下降。

这个曲线可以分成两个部分,一是加入试剂后的指数下降形式,二是后面的直线下降形式

直线下降形式在速率法里说了一点,在这里我们再深入说明一下:

1:酶可以催化底物反应,并且如果底物的浓度足够高的话,酶会催化不过来(反应会达到一个稳定的最大速度)

所以在检测酶的浓度的时候,就是检测这个稳定的最大速度。

所以,正常的酶类项目的反应曲线是一条上升或下降的直线。

因为酶催化的专一性(只催化一种或一类反应),且因为底物浓度足够,才能让反应呈一条直线。

2:如果是普通的终点显色反应(如总蛋白),则是将待测物质转化为显色物质。

反应开始后,待测物质和对应的试剂发生反应,两者的浓度都会下降,

浓度下降后,反应的速度也会下降(这里就没有“催化不过来”的问题了),

所以一般来说,随着反应程度的上升,反应的速度会逐步下降,这是看到的就是一条曲线了。

其次还有像很多目前检测的项目,并不是检测化学上完全均一的物质,

像总蛋白里有分子量相对较大和较小的各种蛋白;

直接胆红素里还有单葡萄糖醛酸、双葡萄糖醛酸和δ胆红素之类的,

这时候,不同物质在参加反应时的基础速率也是不一样的,结合起来之后也会表现为曲线。

所以上面的反应曲线里,直线部分可以认为是正常的酶促反应过程,

而前面的弯曲反应曲线是应该排除的预反应过程。

双试剂的ALT/AST有时会见到这种弯曲的预反应过程,

一般是因为血清中有些干扰物质和试剂里的NADH反应了,导致吸光度下降,

当血清中的干扰物质被试剂反应完后,后面参加反应的就是ALT/AST了,

这时候反应过程就是直线,而且因为干扰物质已经耗尽,所以不会对结果造成影响

上图的反应过程中就是血清中干扰物质较多,在设定的读点区域依然没有反应完,

导致读点区前部出现曲线,并报警“线性异常”

一般的处理方法:

一般情况下就是用这个样本做回收实验,如果有明显异常的话,基本上说明结果肯定有问题

但是如果结果基本符合,并不一定说明结果没有问题,还要参考曲线、病情、用药等一系列信息。

例子中的的这个样本因为我看曲线认为结果偏移应该不大,所以只做了一个高低混合

样本2的ALT可以认为是,AST是.5

这样反推样本1的ALT=x2–=22;AST=x2–.5=22.5

不过这个一般仅做参考,如果结果相差不大的话一般尽量请发布仪器原始结果。

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