前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次。经过不断尝试，改进实验方案，实现了2周重组14个质粒。现把我的经验分享给大家。
回收PCR产物
PCR扩增时，给引物两端设计好酶切位点。一般说来，限制酶的选择非常重要。尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI、HindIII，提前看好各公司的双酶切所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，一般都是加3个保护碱基，平衡GC含量。
回复「克隆」免费申请「一步法无缝克隆试剂盒」，PCR产物无需酶切和纯化，可直接克隆，用于DNA高效定点突变。双酶切时间及其体系
需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要。我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如微升。
纯化问题
纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式。因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。
回复「纯化」查看为你精选的「质粒纯化试剂盒」。酶量的问题
以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位（U）。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（Xpmoles×长度bp×）/0000（注：长度bp×是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套：1pmol0bpDNA=0.66μg，如载体分子量是bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.μg。
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0。另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER，5微升的MARKER每个条带约50ng。
连接反应
TAKARA的连接酶说明书上的写的是过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20μl的连接反应体系中，6μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为U/μl，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
转化
全量（10μl）加入至μlJM感受态细胞中，冰中放置30分钟。
42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
加入μlAMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。
取μl铺板。也可离心后余μl。
回复「感受态」免费试用瑞典进口「E.ColiDH5α感受态细胞」，1分钟完成转化。几个非常重要的问题
做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态。因为连接酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。
对含有氨苄抗性的质粒铺板时，注意加氨苄时的温度。温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培养基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。
为验证双酶切是否成功，可做对照：酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性。如两管均成线性可初步判断双酶切成功。
回复「琼脂糖」免费申请美国进口「翊圣琼脂糖」。做转化时，也要进行对照。设4个对照组：
1.拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功。如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切。如没长出克隆，则证明双酶切成功。当然要保证感受态、培养基、连接酶都正常的情况下。
2.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒。
3.设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。
4.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测感受态状况。
所有的试剂切记低温保存。一步一个脚印，不要偷懒，图省事最后却更费事。注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。
来源：生物学霸
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