文章来源
中华肝脏病杂志，,29（3）:-
作者：
肖二辉胡水旺宁会彬康月花殷辉毛重山康谊尚佳
DOI:10./cma.j.cn--
摘要
目的
筛选慢性乙型肝炎患者经异甘草酸镁（MgIG）治疗前后血浆外泌体的差异蛋白质组。
方法
分别采集36例MgIG治疗慢性乙型肝炎患者前后的血浆标本（2ml/例），利用超速离心方法提取血浆外泌体，利用NanosightNS颗粒粒度分析仪检测外泌体颗粒的浓度和内径。随机各抽取3例MgIG治疗前后组的血浆外泌体，裂解后提取蛋白，利用胰蛋白酶消化后，用液相色谱串联质谱技术进行label-free差异蛋白质组学分析，筛选出变化倍数1.5倍以上的差异蛋白。利用酶联免疫吸附测定技术对感兴趣差异蛋白的表达量进行验证（n=30）。计量资料的比较采用配对样本均数的t检验。
结果
提取的外泌体平均颗粒浓度为2.2×10?个/ml，平均粒径为（±52）nm，与理论血浆外泌体大小值相符，证明成功提取了血浆外泌体。蛋白质组学结果显示，MgIG治疗慢性乙型肝炎患者前后相比较，共筛选出个差异蛋白，包括85个上调蛋白和68个下调蛋白。酶联免疫吸附实验结果显示，慢性乙型肝炎患者MgIG治疗后组和治疗前组相比较，血浆外泌体中肝细胞生长因子激活剂和肝细胞生长因子样蛋白浓度差异有统计学意义（P0.05）。肝细胞生长因子激活剂在MgIG治疗前组血浆外泌体中浓度为（45.9±9.4）μg/ml，在MgIG治疗后组为（13.9±2.0）μg/ml。肝细胞生长因子样蛋白在MgIG治疗前组血浆外泌体中浓度为（23.4±4.9）μg/ml，在MgIG治疗后组为（13.8±2.2）μg/ml。酶联免疫吸附实验结果均与蛋白质组学结果一致。
结论
本研究成功筛选出MgIG治疗慢性乙型肝炎患者前后血浆外泌体差异蛋白质组，为研究MgIG治疗慢性乙型肝炎的分子机制提供实验依据。
正文
全球约有超过2.4亿人感染乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV），在未经治疗的慢性乙型肝炎（chronichepatitisB，CHB）患者中，有15％至40％会发展为肝硬化，最终导致肝衰竭和肝癌[1]。积极治疗HBV感染对阻抑CHB向终末期肝病的发生至关重要，目前国际上常用的治疗方法主要是干扰素、核苷酸类似物和免疫调节剂等[2]。大量的临床研究数据表明，异甘草酸镁（magnesiumisoglycyrrhizinate，MgIG）具有保护肝细胞膜及改善肝功能的作用，能够显著减轻CHB患者的肝纤维化进展，而且对肝细胞的保护作用明显优于同类产品甘草酸苷，见效快，不良反应轻微[3-4]。然而，MgIG治疗CHB的具体分子机制仍然不清楚。外泌体（exosome）是细胞主动分泌的直径约为30～nm囊泡样小体，可携带蛋白质和核酸等多种生物活性分子，并通过系统循环将其转移至邻接或远端的细胞，参与细胞内和细胞间的通讯过程[5]。有研究结果显示，外泌体的内容物在CHB患者HBV感染中的病毒复制和宿主免疫反应等方面可能扮演重要的角色[6]。另外，由于血浆外泌体成分相对简单，可以避免血浆中高丰度蛋白对实验分析的干扰。因此，对MgIG治疗前后的血浆外泌体的蛋白质表达谱进行分析，将有助于揭示MgIG对CHB治疗作用的分子基础。随着蛋白质组学定量技术的进步，label-freeLC-MS/MS技术已经广泛应用于生命科学研究中[7]。本研究拟利用label-free差异蛋白质组学技术对MgIG治疗前后的血浆外泌体的全蛋白谱进行分析，利用酶联免疫吸附（ELISA）技术对候选差异蛋白表达量进行验证，以期为筛选MgIG治疗CHB的靶蛋白提供实验数据。
资料与方法
1.主要仪器：
台式超速冷冻离心机购自美国BeckmanCoulter公司；NanosightNS颗粒粒度分析仪购自英国Malvern公司；SpectramaxM5多功能酶标仪购自美国MD公司；HoeferMiniVE垂直电泳系统购自美国GE公司；ImageScanner凝胶扫描仪购自美国GE公司；EASY-nLC纳升级液相色谱仪和Q-Exactive质谱仪均购自美国ThermoScientific公司。
2.主要材料：
MgIG注射液购自正大天晴药业集团股份有限公司；尿素、蛋白酶抑制剂、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、溴酚蓝、硫酸铵、磷酸、考马斯亮蓝G-、质谱级牛胰蛋白酶、三（2-羧乙基）膦、碘乙酰胺、甲醇、乙醇、甲酸、乙酸、乙腈、三氟乙酸、BCA蛋白定量试剂盒和肽段定量试剂盒均购自美国ThermoScientific公司；Sep-Pak脱盐柱购自美国Waters公司；肝细胞生长因子激活剂（hepatocytegrowthfactoractivator，HGFAC）ELISA试剂盒购自上海研生实业有限公司；肝细胞生长因子样蛋白（hepatocytegrowthfactor-likeprotein，HGFL）ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司。
3.血浆标本的收集与处理：
所有自愿者血浆标本医院感染科住院的CHB患者（年5月—年4月），共36例，包括男性20例，女性16例，年龄24～55岁。分别采集MgIG注射液治疗前后的血液标本，每个患者采集2ml全血，分为治疗前组和治疗后组。MgIG注射液的用法用量为：1次/d，1次0.1g（2支），以10%葡萄糖注射液ml稀释后静脉滴注，连续治疗1周后抽血。医院伦理委员会同意，全部自愿者均签署了实验知情同意书。血浆收集处理实验步骤：每个标本共2ml抗凝全血，4℃，×g离心10min，收集血浆上清液，分装后置于-80℃冰箱中备用。
4.血浆外泌体的分离：
利用超速离心法来分离血浆外泌体[8]，具体步骤如下：每个血浆标本取0.25ml，用11ml磷酸盐缓冲液稀释；0.22μm滤膜过滤；超速低温离心机×g4℃离心过夜；弃上清液，用11ml磷酸盐缓冲液重新悬浮沉淀；×g4℃离心2h。沉淀即为血浆外泌体，冻存于-80℃冰箱中备用。
5.血浆外泌体的鉴定：
利用NanosightNS颗粒粒度分析仪来检测外泌体的数量和大小分布，取10μl外泌体重新悬浮液，利用1×磷酸盐缓冲液稀释倍，加入到上样室中。当nm激光光束穿过样品室的外泌体颗粒后，装有摄像头的显微镜可以实现颗粒的可视化，并记录外泌体布朗运动的视频文件。利用爱因斯坦方程式，根据其运动轨迹计算外泌体的浓度和流体力学直径。
6.血浆外泌体蛋白提取和蛋白定量：
取出血浆外泌体样品置于冰上融化；按1∶10加入蛋白质裂解液（8mol/L尿素，含蛋白酶抑制剂）；冰上超声2min；冰上裂解30min；4℃，0g离心30min，取蛋白质上清液；冰上超声3min，离心取上清液，冻存于-80℃冰箱备用。使用BCA蛋白定量试剂盒提供的标准蛋白质，按其说明书配制不同浓度梯度的牛血清蛋白标准品，蛋白浓度分别为0、0.、0.、0.、0.、1.、1.mg/ml及2.mg/ml；各个样品分别取2μl与18μl超纯水进行混合，然后分别加入μlBCA工作缓冲液。震荡混匀，置于37℃金属浴内反应30min；采用SpectraMaxM5多功能酶标仪测量，选取nm波长进行吸光度测定。最后，根据牛血清蛋白标准曲线与测试样品的体积对样品的蛋白浓度进行计算。
7.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色：
配制5%上胶和12%的下胶，加样完毕后，采用恒电压的模式，电压设置为V，当溴酚蓝电泳至底部距离1～2cm处停止电泳。采用考马斯亮蓝G-胶体考染的实验方法对十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶进行染色。具体步骤如下：凝胶先置入固定液（配方：40%无水乙醇和10%无水乙酸）中进行固定2h；加入超纯水进行漂洗3次，每次15min；向染色槽内倒入新鲜配制的胶体考染的染色液（10%硫酸铵，10%磷酸，0.12%考马斯亮蓝G-和20%甲醇）中，室温下在水平摇床上染色至少24h；使用大量超纯水多次进行漂洗，直至背景很低时停止脱色，将凝胶保存于超纯水中。用ImageScanner凝胶扫描仪获取凝胶图像。
8.外泌体蛋白的酶解和肽段处理：
从治疗前后标本组分别随机抽取外泌体蛋白样品各3例，每个标本取μg，用裂解液补充体积到μl；加入终浓度10mmol/L三（2-羧乙基）膦，在37℃下反应60min；加入终浓度40mmol/L碘乙酰胺，室温下避光反应40min；每管分别加入7倍体积mmol/L三乙胺-碳酸缓冲液稀释样品；按照质量比1∶50（酶∶蛋白）加入质谱级牛胰蛋白酶，37℃酶解过夜。胰蛋白酶消化后，用真空泵抽干肽段；将酶解抽干后的肽段用2%乙腈，0.1%三氟乙酸复溶肽段；用Sep-Pak脱盐柱进行肽段脱盐，脱盐后的肽段样品用真空浓缩仪抽干；使用肽段定量试剂盒进行肽段定量。
9.label-free蛋白定量分析和搜库：
根据肽段定量结果，利用质谱上样缓冲液溶解等浓度为0.5μg/μl的肽段进行液相色谱串联质谱分析，所有的参数如下：数据采集软件：ThermoXcalibur4.0；反相柱信息：C18柱(75μm×25cm，购自美国ThermoScientific公司)；色谱仪器：EASY-nLC；质谱仪器：Q-Exactive；色谱分离时间：min；A：2%乙腈，0.1%甲酸；B：80%乙腈，0.1%甲酸；流速：nl/min；MS扫描范围（m/z）：～1；采集模式：DDA；选择母离子中信号最强的20个进行二级碎裂；一级质谱分辨率：70；碎裂方式：HCD；二级分辨率：17；动态排除时间：30s。本实验数据库网址：
