枯草芽孢杆菌作为一类重要的生防菌，其代谢过程中可产生活性蛋白类、脂肽类、多肽类、细菌素、挥发性脂肪酸等多种类型的抑菌物质，产不同抑菌物质的枯草菌株对不同动、植物致病菌产生一定的拮抗作用。
02弧菌随着养殖水域生态条件的变化、养殖密度的加大及养殖过程中自身污染的加重，弧菌已成为水产养殖动物的主要病原之一，给水产养殖业造成巨大经济损失。对虾肝胰腺坏死、白便、EMS及鲆鲽鳎肠炎、腹水和组织出血等疾病的主要致病因子就是弧菌。
03以菌抑菌目前，在水产养殖生产过程中，抗生素和消毒剂的使用仍是解决水产养殖动物弧菌病的重要手段，它能在短期内起到良好的治疗效果，但其有效时间短，且会破坏水体菌群平衡，造成弧菌再次爆发。因此，以菌抑菌是一种安全可靠的措施，也是未来发展的重要方向。
实验材料噬菌芽孢杆菌菌株由青岛根源集团与中国海洋大学合作筛选，实验在山东省企业技术中心根源研发中心开展，噬菌芽孢液是采用生产配方通过二级发酵而成，一级发酵10h、二级发酵16h，停止培养时芽孢率95%，成熟度92%，pH7.45，总菌量为2.12×CFU/mL。实验室弧菌培养基为E培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.01g，琼脂20g（液体不加），陈海水mL，高压蒸汽℃灭菌20min。池塘水质测定采用水博士试剂盒，购自北京桑普生化。池塘弧菌测定采用TCBS培养基，购自青岛海博生物。实验用指示菌：溶藻弧菌、创伤弧菌和副溶血弧菌分离自中心水生态实验室循环水养虾系统。实验方法01指示菌活化从-20℃冰箱将甘油管保存的病原菌取出融化后，在超净台里按1%接种在E液体培养基中，置于30℃、r·min-1摇床中培养过夜（12~18h），备用。02牛津杯抑菌圈测定将培养好的指示菌悬液稀释10~倍（浓度约CFU/mL），涂布在E固体培养基上，用移液器移取μL的待测样品加入到牛津杯中，30℃恒温培养箱中培养，观察24h平板上的抑菌圈。孔板MIC检测在96孔板中加入μL无菌E培养基，计算1-8孔稀释倍数为2、4、8、16、32、64、、。3个重复并作空白对照。30℃、r/min的摇床上孵育16h，用酶标仪测定nm处吸光值（OD），记录实验组OD明显大于对照组的稀释倍数，换算噬菌芽孢液提取液最小抑菌浓度（MIC）。04池塘抑菌实验实验1于年4月下旬在山东省东营市小温棚进行。选取条件一致的水泥池15个，随机分为5组，每组3个平行。分组如下：A组：过硫酸氢钾2mL/m3；B组：噬菌芽孢液2mL/m3；C组：噬菌芽孢液1mL/m3，间天再用一次；D组：噬菌芽孢液5mL/m3。实验2于年9月下旬在江苏省南通市小棚进行，噬菌芽孢液产品用量为1mL/m3，隔天再使用一次。从20个小棚中选择6个弧菌含量较多的小棚-2号、3号、9号、13号、14号、15号进行实验。
实验结果01实验室评价采用牛津杯测定抑菌物质抑菌圈的方法，涉及到抑菌成分在固体培养基中的扩散，抑菌圈直径大小受到物质本身扩散性、培养基厚度和含水量的影响，就噬菌芽孢液而言液体粘稠，在培养基扩散受到一定影响，但总体而言，噬菌芽孢液对指示剂创伤弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌均有明显的抑制作用（图1）。在发酵不同时间取样检测发现，采用生产配方进行发酵，自8h开始出现明显抑菌圈，并逐渐增大至稳定（图2、图4）。与常温存放的噬菌芽孢液相比，采用75℃水浴20min或℃高温灭菌30min后，噬菌芽孢液的抑菌圈无明显变化，说明其抑菌产物具有较好的热稳定性（图3）。采用96孔板法测定噬菌芽孢液对副溶血弧菌的最小抑菌浓度为6.25%（图5）。图1噬菌芽孢液对不同弧菌的抑菌观察
图2噬菌芽孢不同发酵时间抑菌圈观察
图3高温处理对噬菌芽孢液抑菌圈影响
图4噬菌芽孢不同发酵时间抑菌圈跟踪
图5噬菌芽孢液96孔板最小抑菌浓度
02水泥池抑菌评价通过检测显示该养殖场实验前后水质指标较稳定，可基本排除水质等因素对弧菌变化的影响。通过跟踪实验期间养殖池弧菌变化表明，使用5mL/m3的噬菌芽孢液效果最佳，在5天内弧菌去除率均能保持在80%左右；使用2mL/m3的噬菌芽孢液与使用2mL/m3的过硫酸氢钾效果相当，前2天弧菌去除率达到50%左右，第3天去除率下降至20%左右，第5天弧菌达到初始水平；使用1g/m3的噬菌芽孢液，间隔一天再使用一次，弧菌去除率在前3天均能达到较高水平（50%左右），在第5天去除率下降至30%左右。综上，噬菌芽孢液弧菌去除率5mL/m3＞1mL/m3使用2次＞2mL/m3≈2g/m3过硫酸氢钾。说明在弧菌较多的高密度养殖池中使用噬菌芽孢液，能够明显抑制弧菌的生长与繁殖，随用量升高，抑制效果变强，且与使用方法有关，其在水体中有效时间长于过硫酸氢钾（图6）。
图6使用不同含量噬菌芽孢液后工厂化水泥池中弧菌含量变化
03如东小棚抑菌评价实验期间为南美白对虾养殖的中期，虾具有很强的搅水能力，池塘水始终处于混浊状态，透明度很低，6~7cm。实验期间水质相对稳定、亚硝酸盐较高，pH8.4左右、氨氮0.2~0.6mg/L、亚硝酸盐3~6mg/L，藻相硅藻+绿藻水为主，偶见裸藻。使用了噬菌芽孢液后，6个池塘中弧菌含量逐渐减少，降低1-2个数量级，说明实验中噬菌芽孢液对如东小棚模式池塘中的弧菌具有明显的去除效果（表1、图7）。表1如东小棚中使用噬菌芽孢液后弧菌数量变化
图7使用噬菌芽孢液前后弧菌数量变化
主要结论本研究对青岛根源集团研发中心与中国海洋大学合作筛选的噬菌芽孢进行了规模发酵（30吨发酵罐），在实验室内及养殖水体中进行了效果评估，结果表明该菌株具有可观的产业化价值，发酵液自8h开始可检测到抑菌效果，上清液对副溶血弧菌96孔板MIC6.25%，并且代谢产物对高温高压稳定，除可在养殖现场使用外、可用于水产饲料添加。池塘抑菌实验表明使用5mL/m3可起到很好的抑制病原菌的效果，后期产业化后考虑到使用成本，可采用使用1mL/m3隔天补用1次的方法。
特别致谢：感谢三角洲养殖公司、如东县凌杨农场杨总对该研究的大力支持。
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