9月29日至30日，普洱茶学教育部重点实验室联合云南农业大学普洱茶学院和食品科技学院，派出9组采样人员在昆明市雄达茶城、金实茶城、邦盛国际茶城、大商汇茶城集中采集普洱茶样品。工作人员共采集样品份，所采样品涵盖不同的产地来源、储存年份、价格分布、外观形态和生茶/熟茶。
9月29日至10月9日，研究人员在普洱茶学教育部重点实验室对所采集样品进行了黄曲霉毒素B1的研究检测工作。采用改进的酶联免疫吸附筛查法（ELISA法）和高效液相色谱（HPLC）-柱后衍生法（国标规定方法）复查。检测结果为：在所有的份样品中，改进ELISA法筛查后共检测到疑似阳性样品27份（假阳性率2.3%）；经改进的HPLC-柱后衍生法复查，所有27个疑似阳性的样品全部判定为阴性；在改进的ELISA法筛查判定为阴性的样品中，随机抽取25份进行HPLC柱后衍生法复查，检测结果全部为阴性。
本次昆明茶叶交易市场研究检测结果表明，所有样品均未检出黄曲霉毒素B1。
云南农大研究团队表示，近期将对广东茶叶交易市场进行研究检测，并及时公布研究检测结果。云南农大将同时公布改进的ELISA法和改进的柱后衍生法，供检测机构和相关研究人员用于检测茶叶黄曲霉毒素B1。云南农大将开放普洱茶学教育部重点实验室，对企业和市场上的茶叶产品提供检测技术咨询服务。
昆明市内采样检测普洱茶中黄曲霉毒素B1
研究报告
一、 采样
1. 采样日期：年9月29日-年9月30日。
2. 采样地点：昆明市雄达茶城、金实茶城、邦盛国际茶城、大商汇茶城。
3. 采样人员：共9组，每组4-6人，每组带队教师1-2名，其余人员为硕士和博士研究生；所有人员来自于云南农业大学普洱茶教育部重点实验室、龙润普洱茶学院和食品科学技术学院。
部分采样现场图
4. 所有样品为随机抽查，共采样份；
5. 样品原产地来源分布：
6. 生茶/熟茶分布比例：
7. 茶外观形态分布比例：
8. 样品购买价格分布比例：
9. 样品保存年份统计结果：
二、 检测
检测时间为年9月29日-年10月9日，参与人员为普洱茶学教育部重点实验室工作人员、北京华安麦科生物技术有限公司技术支持工程师（彭石），其余为博士生、硕士生和本科生，共计39人。
检测团队部分成员（年10月2日完成样品粉碎工作后）
检测项目包括改进的ELISA检测和高效液相（HPLC-柱后衍生）两种检测方式。其中ELISA方法用于初筛，高效液相（HPLC-柱后衍生）用于结果确认。
（一）茶样粉碎
1拍照
用相机拍照每一茶样，记录，并按地区分好类。
部分茶样
2粉碎
采用邦杰多功能粉碎机进行粉碎，型号为BJ-A。取完整的一饼茶（沱茶、饼茶、散茶、茶砖等），将茶饼外面的包装纸剥开，将包装纸放入自封袋内（以便以后追溯原始数据）。首先茶饼是否完好，有无发霉，做好记录，然后在11号自封袋上用锤子砸成小块，将茶块放入粉碎机中粉碎成粉末（约目）。
发霉的茶样
在份样品中，发现4份明显发霉的茶样，占样品总数的0.34%。
茶样粉碎过程
将粉碎完成的茶粉取出，粉碎机用水清理干净，继续下一个样品的粉碎。将粉碎的样品分成等量的两部分，用电子天平称重，分别装入8号自封袋中，标记好重量和产地等信息。将分装好的茶粉，一份送去检测，另一份放入箱中进行封存。
茶样的称量与标号
（二）改进的ELISA法检测
使用黄曲霉毒素B1ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样本中黄曲霉毒素B1残留。所用试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代真菌毒素检测产品（来自北京华安麦科生物技术有限公司），与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等优点，操作时间仅需45min，能最大限度地减少工作强度和操作误差。
ELISA试剂盒
在北京华安麦科生物技术有限公司技术部门和工程师（彭石）的协助下，优化了样品前处理方法，以尽可能地排除茶样中其他成分的干扰。
之前的前处理方法为甲醇/水=80：20或甲醇：2%NaCl为提取溶剂，改进后采用%乙腈提取，可以去除更多的茶色素，减少茶样中色素对检测结果的干扰。
1改进的样品前处理步骤
（1）将粉碎后的普洱茶标号（份样品），每份样品混匀后称取5.0g（±0.1g）有代表性的茶叶置入50mL离心管中（标记），然后向离心管中加入25mL分析乙腈与其混合；
（2）将样品放摇床上剧烈振荡10分钟，转速为r/min；
（3）然后将样品于r/min离心机离心5min；
（4）取上清1mL于15mL离心管中，再加入7mLup水稀释，混匀后取50μL进行测定；
（5）将剩余的样品取10mL上清液于15mL离心管中，放4℃冰箱备用。
2操作步骤
（1）将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上。
（2）用去离子水将浓缩洗涤液（10×）按1:9体积比进行稀释，备用。
（3）取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2～8℃。
（4）编号：将样本和标准品对应微孔按样品编号记录在ELISA上样表上，标清标准品孔和样本孔所在的位置。
（5）加标准品/样本：加入标准品或样本50μL到对应的微孔中（加入前用手摇匀标准品和样品），加入AFB1酶标物50μL/孔，再加入AFB1抗试剂50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。
（6）洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。
（7）显色：加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应15min。
（8）测定：加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于双波长/nm处，测定每孔OD值。
3结果判定
用RidasoftWin.NET软件计算样本吸光值与其所含的黄曲霉毒素B1，计算数值大于1.5的样品，重新按上述步骤复测两次。初筛为阳性的样品再找另外两位检测人员分别单独复检，三次检测结果中两次为阳性的则判为“试剂盒检测阳性”，三次检测结果中两次为阴性的则判为“试剂盒检测阴性”。
改进的ELISA试剂盒法检测过程
4检测结果
4.1首次检测阳性比例图
所有样品共计个样品，首次检测为阳性个数为个，占总样品数的比例为17.9%；
4.2复检样品阳性比例图
样品复检后被判为阳性结果的为27个，占总样品数的比例为2.28%。
所有ELISA检测结果判为阳性的样品，经免疫亲和柱纯化后全部用HPLC进行复核。除此之外，从第一次ELISA检测为阳性的样品（-27=个）中随机抽取10个（比例为5.4%）；从第一次ELISA检测为阴性的样品（-=个）中随机抽取15个（包括肉眼观察发现发霉的样品，比例为15.4%）进行HPLC-柱后衍生复核。
（三）黄曲霉毒素B1免疫亲和柱操作方法
1配液
（1）提取液：80%乙腈-水溶液（V乙腈：V水=80:20）
取mL乙腈，加入20mLUP水，混匀，过0.22μm微孔滤膜（有机系）。
（2）1%吐温-水溶液：取1mL吐温-20，加入UP水动容至mL，过0.22μm微孔滤膜（水系）。
2样品处理
（1）5g±0.01g样品（需粉碎）加入25mL提取液，混匀。
（2）摇床（r/min）剧烈震荡10min，震荡后离心，r/min，5min，将离心后的样品取出上清液，调pH6-8（1MNaOH）。
（3）取5mL上清液加入35mLUP水，用0.22μm微孔滤器过滤（有机系），收集滤液作为上样液。
（4）取10mL上样液过免疫亲和柱净化。
3操作程序
（1）将气控操作架与空气泵安装完毕，阀门全部保持关闭状态，将注射器（10/20mL）（去掉针头和活塞，只留注射器的空筒）安装在气控操作架上。
（2）取出免疫亲和柱，用针头将上方塞子戳一个洞，将免疫亲和柱与气控操作架上的注射器固定在一起。
（3）取10mL上样液置于注射器中，将气控操作架的塞子安装于注射器上，去掉亲和柱下方堵头，打开空气泵，调节开关，使液体以1-2滴/秒的速度流出。
（4）待液体排干后，用10mLUP水洗涤两次，流速2-3滴/秒；对于颜色附着比较深的样品，先用1%Tween-20水溶液洗涤10mL，再用UP水洗涤10mL，流速2-3滴/秒。
（5）待液体排干后，从注射器上去下亲和柱，去掉上方的塞子，用洗耳球堵住亲和柱吹气，尽可能将亲和柱中残留的水完全排干，完全排干后，上样1mL甲醇（色谱级），用洗耳球轻轻吹下一滴液体后，使样品自由滴下，而不再施加外力，收集洗脱液，待柱身中液体排干，且不再有液体滴下，用洗耳球将柱中剩余液体吹下，收集洗脱液1mL。
（6）洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤（有机系）过滤转移至样品瓶用于HPLC分析。
（四）黄曲霉毒素B1高效液相检测方法
1材料
C-18检测柱、色谱级甲醇、双蒸水、0.45μm滤膜、1ml注射器
2仪器：
安捷伦高效液相色谱、光化学衍生器、FLD荧光检测器
3色谱条件
流动相：55%甲醇溶液;
流速：1ml/min；
上样量：μl
检测柱：安捷伦Zobax-C18，柱温40℃；
检测器：荧光检测器（激发nm、发射nm）；
检测时间：15min；
4检测过程
（1）打开泵、柱温箱、光化学衍生器、荧光检测器，用55%甲醇溶液平衡C-18柱子；
（2）C-18柱平衡以后，取已经过了纯化柱的滤液，用0.45μm滤膜进行过滤到检测小瓶内；
（3）完成过滤的液体放入液相样品盒内；
（4）使用55%甲醇的液体作为流动相，进行检测，检测时间为15min。
5检测结果
液相检测（HPLC-柱后衍生）黄曲霉毒素B1保留时间为8.min，以标准品浓度1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、25ng/ml对峰面积求出标准品的线性回归方程，并绘制校正曲线。结果表明，AFB1的线性回归方程为：Y=0.*X-0.，相关系数为0..
黄曲霉毒素B1标品
标准曲线
液相检测样品图谱：
普洱茶样品17
普洱茶样品
普洱茶样品
普洱茶样品
普洱茶样品
普洱茶样品
普洱茶样品
普洱茶样品
普洱茶样品
所有进行HPLC检测的样品共52个在保留时间8.min附近均没有响应。
结论：在昆明市主要的茶叶交易市场随机采样份，检测研究结果表明，所有的茶叶样品均未检出黄曲霉毒素B1.对于茶样品的检测，无论是ELISA法还是HPLC法，样品前处理尽可能去除掉更多的杂质干扰都是检测结果准确的关键，采用本研究中使用的改进的提取方法，能够保证检测结果更准确。
更多研究检测细节和详细数据
