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烯烃的反马氏氧化/水合反应，长久以来都被认为是一个非常重要却又难以攻克的反应。合成化学家为实现这一转化提供了“硼氢化-氧化”的策略，但该策略步骤冗长且需要过量有机硼试剂，终究难以成为最理想的合成途径。除此之外，虽然也有一些烯烃反马氏催化氧化的例子，但多数依赖贵金属催化剂，反应效率不高，或需要当量的特殊氧化剂参与；而且到目前为止，这些策略中并没有任何一例实现了不对称的烯烃反马氏氧化。如果能利用氧气作为终端氧化剂，且能找到高活性高选择性的催化剂来实现烯烃的反马氏氧化，这样的策略工业应用前景极其光明。
近日，美国加州理工学院的化学家FrancesArnold教授课题组在该领域取得突破，她领导的研究团队通过定向进化获得了一种基于细胞色素P单加氧酶（cytochromePmonooxygenase）的新型工程酶aMOx，可以利用分子氧为终端氧化剂，高效催化烯烃的反马氏氧化反应，并且报道了首个不对称的反应例子。该工作发表在近期的Science上，StephanHammer为第一作者。
FrancesArnold教授。图片来源：CaliforniaInstituteofTechnology
酶是自然界中的一种生物大分子，也是天然的催化剂。在酶促反应机制的漫长研究历史中，人们意识到这种高效的天然催化剂有别于有机化学家所创造的小分子催化剂，它们能够通过在过渡态时与底物的多重相互作用，有效地控制底物构象，稳定高能量中间体，从而得到期望的产物同时也抑制副反应的发生。基于细胞色素P的氧化反应，往往先形成一个被称为“CompoundI”的铁氧（Fe=O）配合物中间体，它作用于烯烃发生协同过程的氧转移，生成环氧化产物。在此机理之上，作者希望通过调节酶活性位点的结构，使该反应打断原先的协同过程，形成碳正离子并由酶稳定，继而发生1,2-氢迁移实现烯烃直接的反马氏氧化反应，与此同时环氧化产物也得到抑制。
P的协同机理和分步机理。图片来源：Science
在后续的实验中，该设想得到了证实。在一种来自于红细菌Labrenziaaggregata的P变体——PLA1催化的苯乙烯氧化反应中，作者检测到生成了苯乙醛，但产物中仍有大量的环氧化物。随后，作者使用定向进化的手段提高PLA1的反应性和选择性。作者首先在酶的血红素结合位点引入随机突变，经过系统筛选得到了一个PLA1的五重突变体，成功地将反应的总转换数（TTN）从原先的提高到了。然而，反应的选择性并未有明显提升，仍停留在50%左右。作者认为，对酶中的活性位点和血红素结合位点进行突变有可能可以提高反应的选择性。自此，作者对这些活性位点展开了单点饱和突变，以筛选产生更高选择性的突变。组合获得的所有有利突变后，作者得到的突变体aMOx能使苯乙烯氧化生成苯乙醛的反应选择性达到81%，同时TTN达到。
之后，作者在反应体系中加入了环氧化物（(R)-3和(S)-3，下图B），发现这些环氧化物都不能和aMOx作用，而且产物中醛与环氧化物的比例不随时间改变，证实了产物醛的生成并不是经由环氧化物的异构化所得。之后，作者也用同位素标记实验证明了在反马氏氧化过程中他们所设想的1,2-氢迁移的过程。基于此，作者推测由于酶活性位置是一个手性环境，那就有可能借此来调节1,2-氢迁移的面选择性，从而实现不对称的反马氏氧化。果不其然，在α-甲基苯乙烯作为反应底物的时候，能以91%的对映选择性生成(S)-异构体，这也是在所有烯烃反马氏催化氧化策略中，首个不对称的例子。
定向进化获得aMOx与反应机理探究。图片来源：Science
作者接下来利用aMOx与醇脱氢酶（ADH）在体外环境的串联反应，展示了aMOx在合成生物学领域的应用潜力。该串联反应可以在单一反应体系内将烯烃转化为反马氏水合产物，只需要当量的氧气和异丙醇即可。而此前的报道中，实现这种转化或需要贵金属催化剂，或无法实现立体选择性。在这个双酶体系中，ADH能够对映选择性地还原第一步生成的羰基化合物，同时利用异丙醇实现再生。作者尝试了不同的取代苯乙烯底物，取代基电子效应并没有产生明显影响；就位置效应而言，对位取代的影响最小。对于α或β位取代的苯乙烯，该串联路径实现了高立体选择性的手性醇合成。
aMOx与ADH联用的底物适应性。图片来源：Science
——总结——
FrancesArnold教授课题组发展了一种基于血红素辅基的工程酶——aMOx，对烯烃的反马氏氧化反应具有高度的催化活性，并具有合成手性醛化合物的潜力。尽管底物适用范围还局限在芳基取代烯烃，其反应的优点已毋庸置疑，包括高活性、高化学/立体选择性、氧气作为终端氧化剂等。如作者指出，通过对现有酶催化剂进行改进，是可以进一步解决脂肪族烯烃的反马氏氧化的难题（研究正在进行中），甚至挑战目前化学催化无法实现的化学转化。
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