豆欣喜1,2,3，张明4，林材5，吴殿辉1,2,3，李晓敏1,2,3，孙军勇1,2,3，蔡国林1,2,3，陆健1,2,3*
1(江南大学，工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，)2(江南大学，粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡，)3(江南大学生物工程学院，江苏无锡，)4(江苏省农垦麦芽有限公司，江苏射阳，)5(华润雪花啤酒有限公司，河北秦皇岛，)
摘要将GeneBank中人源乙醛脱氢酶2的基因序列根据酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的密码子偏好性进行密码子优化后合成目的基因ALDH2，采用融合PCR技术，构建人源ALDH2基因的表达组件TRP1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-TRP1R。通过电转化的方法将基因表达组件通过同源重组整合到酿酒酵母W-1A的基因组上，获得基因工程菌W-ALDH2。工程菌发酵后的粗酶液经HisTrapTMexcel亲和层析柱纯化获得重组ALDH2，其活性为20.70U/mg；重组酶的相对分子质量是56kDa；最适反应pH和温度分别为5.0和35℃；除Na+外，K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+均能不同程度地提高ALDH2的酶活。以乙醛为底物测得酶的Km值为0.mmol/L，最大反应速度Vmax为.94U/mg；以辅酶NAD+为底物测得酶的Km值为0.mmol/L，最大反应速度Vmax为58.82U/mg。
关键词人源乙醛脱氢酶2；酿酒酵母；克隆表达；酶学性质
乙醇在人体内的代谢主要靠体内的2种酶[1]，一种是乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenases,ADH,EC1.1.1.1)，将乙醇氧化成乙醛；另一种是乙醛脱氢酶(Acetaldehydedehydrogenase,ALDH,EC1.2.1.10)，将乙醛氧化成乙酸。一般情况下，ADH可充分表达，缺乏ALDH的个体比较多，导致乙醛在体内大量积累，产生醉酒症状[2]，同时会损伤肌体细胞，容易诱发肝癌[3]。目前，在人体中已发现19种ALDH，主要分布在肝、胃、心脏等器官中，最常见的有ALDH1、ALDH2、ALDH3、ALDH4四种[4]。其中，参与乙醛氧化的主要是ALDH1和ALDH2，ALDH2的催化活性是ALDH1的10倍[5]。所以ALDH2是人体酒精代谢的关键酶，近年来，随着人们对获得全新的、更有效的解酒保肝药物的需求日益迫切，关于高效表达乙醛脱氢酶2编码基因ALDH2的研究工作更显出其深远意义。
很多科研工作者将ALDH2基因导入大肠杆菌或毕赤酵母的表达体系中，以构建高产ALDH2的工程菌[6-7]。但是大肠杆菌是一种致病菌，毕赤酵母表达ALDH2时需要用甲醇诱导，这对产物的安全性具有一定的影响，解酒药物的研究也受到了限制。酿酒酵母Saccharomycescerevisiae作为第一个完成全基因组测序的真核生物[8]，很早就被应用于食品和饮料工业，已被成功地表达了大量的真核外源蛋白，酿酒酵母能对外源蛋白质进行一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，这有利于保持生物产品的活性和稳定性[9-11]。
但是酿酒酵母表达系统仍有缺点：与大肠杆菌表达系统和经甲醇诱导的毕赤酵母表达相比，游离的质粒在酿酒酵母中表达，由于没有选择条件的压力，在发酵过程中会出现质粒丢失的问题；整合到酵母基因组上的质粒虽然稳定性好，但质粒不能独立于酵母染色体外进行自主复制，这就会出现拷贝数低，目的产物表达量不高的问题。综合上述各种表达系统的优缺点，本研究将人源ALDH2基因针对酿酒酵母进行了密码子偏好性优化后，与组成型强启动子TPIp一同整合到酵母的基因组上来表达人源ALDH2基因；在工程菌发酵过程中不需要添加诱导剂，产物相对比较安全，并对该重组酶的最适作用温度、最适pH、温度稳定性、pH稳定性、金属离子对比酶活的影响以及动力学进行了研究，以期为解酒酶制剂的研究提供理论依据。
1材料与方法1.1材料1.1.1菌种和质粒
酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeW-1A(MATaΔura3Δtrp1Δleu2Δhis3)和N85(MATa/MATα)，大肠杆菌EscherichiacoliJM以及表达质粒pYX均由本实验室保存，克隆载体pMD18-Tsimplevector购自宝生物工程(大连)有限公司。其中：质粒pYX携带有Ampr抗性基因和磷酸丙糖异构酶的组成型强启动子TPIp及其终止子TPIt。
1.1.2主要酶和试剂
PrimeSTARDNAPolymerase，ExTaqDNAPolymerase，rTaqDNAPolymerase，T4DNALigase，BamHI，EcoRI，MiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKit试剂盒，DNAMarker、标准蛋白Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒、氨苄青霉素(Amp)、YNB(YeastNitrogenBase)、L-亮氨酸、L-色氨酸、L-组氨酸、腺嘌呤、蜗牛酶和辅酶NAD+购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他试剂均为市售国产或进口分析纯产品。目的基因ALDH2及引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA片段测序均由上海睿迪生物技术有限公司完成。
1.1.3主要仪器
琼脂糖凝胶电泳仪，美国Bio-Rad公司；JD-凝胶成像仪，江苏省捷达科技发展有限公司；SpectraMaxPlus酶标仪，美国MDC公司；HisTrapTMexcel(1mL)色谱柱，GEHealthcare公司；MastercyclerproPCR仪，德国Eppendorf公司。
1.1.4目的基因和引物的合成
将GeneBank中人源乙醛脱氢酶2的基因序列根据酿酒酵母(S.cerevisiae)的密码子偏好性进行密码子优化后合成目的基因ALDH2，连接克隆载体pUC57后，得到重组质粒pUC57-ALDH2。其中，ALDH2基因的两端分别具有BamHI和EcoRI的酶切位点。
表1本实验中所使用的引物Table1Primersusedinthestudy
注：下划线为用于融合PCR的重叠序列。
1.2实验方法1.2.1重组质粒pYX-ALDH2的构建
重组质粒pYX-ALDH2的构建过程如图1所示。首先，使用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒pUC57-ALDH2和pYX，分别经EcoRI和BamHI双酶切，用胶回收试剂盒回收目的基因ALDH2(bp)和线性化载体pYX(bp)，然后在T4连接酶的作用下，16℃保温过夜，将目的基因与载体连接，并转化至大肠杆菌JM的感受态细胞[12]，涂布含有Amp的LB筛选培养基平板，37℃培养12h左右，挑取平板上长出的菌落使用引物F5/R5进行菌落PCR，并且提取阳性克隆子的质粒分别进行双酶切和测序验证。
图1重组质粒pYX-ALDH2的构建Fig.1Constructionofre什么是泛发型白癜风北京市白癜风治疗医院
