测试原理:常规的DNA含量的检测方法是在nm(A)处测其吸光值。这种方法的主要缺点是核苷酸、单链核酸和蛋白质对信号的影响很大,并且还会受到核酸制备过程中污染物的干扰,无法区分DNA和RNA,而且这种方法不灵敏。Hoechst染料是一种非常灵敏的荧光染料。H选择性的与双链DNA结合。在有蛋白的情况下荧光信号并不显著增加,因此可检测和定量低至10ng/ml的DNA。Hoechst,一种二苯甲亚胺DNA结合物,它在紫外区(nm)附近被激发,发射波在蓝光区(nm),检测更灵敏。小牛胸腺DNA由于是双链、高度聚合并含有大约58%的AT(42%GC)而经常被用作动植物DNA的对照。
试剂药品:
Hoechst、三(羟甲基)氨基甲烷、EDTA、氯化钠、浓盐酸、小牛胸腺DNA
具体操作步骤:
1)配制1mg/mLHoechst:1mL的Hoechst(10mg/mL)加9mL的用0.45μm滤膜过滤的蒸馏水稀释而成;
注:Hoechst可能会致癌和导致基因突变,操作时须带手套、面罩,并且在通风橱内操作。
2)配制10XTNE储存缓冲液:称12.11gTris碱[三(羟甲基)氨基甲烷],分子量=.14(mM);3.72gEDTA乙二胺四乙酸,二钠盐,二水合物,分子量=.20(10mM);.89g氯化钠,分子量=58.44(2M)。用1M的HCl调节溶液pH至7.4,补加超纯水定容到0mL,使用前用0.45μm滤膜过滤,4℃可保存3个月;
注:pH和氯化钠浓度对于Hoechst试剂和DNA的结合至关重要。
1X的TNE:取90mL蒸馏水(0.45μm滤膜过滤)稀释10mL10X的TNE。
3)配制Hoechst工作液(1μg/mL):取50mL1X的TNE缓冲液加入5μL的Hoechst储备液(1mg/mL)。室温放置,现用现配,一旦染料加入千万别再过滤!
注:0.1μg/mL的染料浓度足够检测约ng/mL的DNA终浓度,增大染料浓度(1μg/mL)将扩大DNA的检测范围(15μg/mL),但会限制低浓度的灵敏性(5-10ng/mL)。
4)配制小牛胸腺DNA标准液:准备溶解在1X的TE浓度为1mg/mL的小牛胸腺DNA储存液,轻击小管充分混匀,4℃可保存3个月。逐级稀释制备标准液,至少7个点;
5)测试样品配制:1.5mL的EP管加入1mL的Hoechst工作液(1μg/mL),加入10μL裂解液(标准液),避光孵育5分钟,96微孔板每孔加入μL,用酶标仪处测量吸收波长为nm、发射波长为nm处的吸光度值。
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