肿瘤细胞侵袭实验的开展
肿瘤细胞侵袭能力检测在肿瘤学（迁移、侵袭）和免疫学（迁移、趋化）中是常规实验。
1.侵袭是细胞迁移的一种。细胞迁移分三种类型：趋触、趋化和侵袭。
.肿瘤细胞的侵袭性是肿瘤相关信号通路、药物治疗、靶向治疗、致癌/抑癌基因等肿瘤学研究的一个重要指标。
3.免疫细胞具有趋化性，例如粒细胞、巨噬细胞、单核细胞对CCL、CXCL类因子的趋化性，免疫细胞异常（如过度趋化）通常会引起一些炎症类疾病如风湿、关节炎、牛皮藓、动脉粥样化等
具体开展1.复苏代数靠前的肿瘤细胞，在含有10%FBS的培养基中预先培养-3代，待细胞汇合达到80%左右，饥饿处理18-4小时。
.准备铺胶：
a）4°C溶matirgel胶过夜
b）将细胞小室、培养板和枪头等于4°C预冷
c）用无血清的冷培养基稀释matirgel胶至一定浓度，加入到细胞小室的上层（按照产品说明书的推荐比例和体积），轻轻摇晃使胶均匀铺在膜上。以上操作在冰上进行
d）立即将铺好matrigel胶的细胞小室置于培养板中，于37°C孵育1小时左右，matirgel胶可由液体凝成固体，吸走多余的或者未凝的胶
3.细胞用PBS清洗一次，胰酶消化，然后用包含5%BSA的无血清培养基中和，rpm离心5-10min。
4.用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度
5.取上述细胞液加入小室，下室（培养板）加入含有10%FBS的培养基。不同规格的小室和培养板所加的体积不同，具体参考产品说明书
6.37°C孵育4至7小时，依据肿瘤细胞类型而定
7.孵育结束，小心取出细胞小室，吸掉小室上层培养液，PBS清洗一遍，70%酒精或者4%多聚甲醛固定5min，0.5%结晶紫（%乙醇或PBS溶解）染色0min，然后进行第8步或者第9步。
8.PBS清洗两次以去除多余的染料，立即用棉签擦去滤膜上层的细胞，自然静置风干。显微镜下观察滤膜下层的细胞，随机选取不同的视野计数并算平均值。
9.结晶紫溶解滤膜下层细胞，然后用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上nm读取OD值。这种方法可以避免视野下细胞穿透不均匀带来的误差。
技术要点1.肿瘤细胞最好经过饥饿处理，并且小室上下培养基的FBS有浓度差，以保证细胞可以穿透基质胶
.铺细胞要均匀，滤膜底部不能产生气泡，否则会导致细胞染色不均匀，或者局部细胞无法穿透。
3.根据细胞类型选择合适的膜孔径和膜类型。PET膜兼容广泛，适合绝大多数种类的细胞。
4.侵袭实验的细胞密度比较大，不同肿瘤细胞的接种密度、培养时间不同，需要参考文献和实验摸索。细胞太少，迁移不过去；细胞太多，可能导致正常组和实验组无差异。
5.首次做实验需要用正常的细胞摸索合适的细胞密度和培养时间，确定之后再加实验组，同时如果条件允许，设置一组已知高迁移性的细胞作阳性对照。
6.注意细胞小室内外培养基的比例，不要使小室外培养基超过小室内培养基液面。
7.观察细胞时一定要擦去小室内部贴在膜上的细胞。
1Matrigelmatrix的组成是什么？
问＆答-------------------------------------------
Matrigelmatrix是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取的基底膜基质，其中含有约60%层粘连蛋白、30%IV胶原和8%的巢蛋白。康宁Matrigelmatrix还含有基底膜聚糖、TGF-?、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、组织纤溶酶原及其他生长因子。
融化Matrigelmatrix需要多长时间？
问＆答-------------------------------------------
需要放置于冰上，并在oC-6oC的冰箱中或者冷室中过夜融化，蛋白浓度高时可能需要更多时间。
3使用Matrigelmatrix时需要预冷移液管和管子吗？
问＆答-------------------------------------------
是的。因为Matrigelmatrix在10oC以上时会成胶，操作Matrigelmatrix时，我们建议使用预冷的移液管、吸头和管子。
4高浓度Matrigelmatrix用于哪些实验？
问＆答-------------------------------------------
高浓度的Matrigelmatrixmatrix可适用于体内应用研究，如高浓度蛋白可促进肿瘤生长。高蛋白浓度同时可使Matrigelmatrix注射入小鼠皮下后保持完整，有利于注射的肿瘤细胞和/或血管生成因子保持原位，便于用于原位分析和/或以后的切除。
5如何将Matrigelmatrix用于3D培养？怎样制作3D胶？需要将细胞嵌入到Matrigelmatrix中吗？
问＆答-------------------------------------------
高浓度的Matrigelmatrix可适用于体内应用研究，如制备厚层包被用于3D细胞培养。细胞可以嵌在Matrigelmatrix中或者接种在Matrigelmatrix表面（覆盖法）。
6Matrigel?matrix的最低成胶浓度是多少？
问＆答-------------------------------------------
不同的实验目的需要不同的Matrigel浓度，用户应该根据具体的实验需求确定。Matrigel?matrix最低成胶浓度为3mg/mL。稀释时不要简单进行体积倍比稀释，不同批次间的Matrigel浓度有差异，应该根据最终工作浓度(mg/mL)算出需要加入的稀释液体（如PBS或无血清培养基）的量。用于体内研究的Matrigel，为了避免成胶不完全，最终工作浓度不应低于4mg/mL。
7什么情况下，需要使用无酚红Matrigelmatrix？
问＆答-------------------------------------------
对于涉及颜色检测的实验，推荐使用无酚红Matrigelmatrix，如使用荧光染料或Drabkins法计数内皮细胞成管实验。对于子宫内膜细胞培养，也需使用无酚红Matrigelmatrix。
此外，酚红和非甾体雌激素结构类似，有类雌激素效应。在实验动物体内可能具有干扰内分泌和荷尔蒙代谢的能力。
8Matrigel?matrix包被过的培养皿可以储存多长时间呢？
问＆答-------------------------------------------
包被过的培养皿最好当天使用，具体情况取决于实验目的。需要保存的情况下，可在37°C培养箱中最多存放7天。保存时Matrigel表面需要使用无血清培养基均匀覆盖，保持湿润。
9哪些情况下应该选用薄胶？什么时候用厚胶呢？3D培养有哪些应用？
问＆答-------------------------------------------
薄胶主要用于辅助细胞贴壁，有利于细胞增殖。如原代细胞培养，需要一层薄薄的蛋白层辅助，就可以选用薄胶；厚胶主要用于3D细胞培养，如大鼠主动脉组织分化为毛细血管样结构（RingAssay），以及进行细胞侵袭实验等；3D细胞培养实验，主要是用于研究细胞与细胞间的相互作用以及复杂结构，如生物组织等。
10进行内皮管形成实验，应该选用多大浓度的Matrigel呢？
问＆答-------------------------------------------
进行该实验，Matrigel最低浓度应不低于10mg/mL。
11做细胞侵袭实验，需要使用多少Matrigel?matrix进行包被？
问＆答-------------------------------------------
包被4孔通透性支持物，推荐每孔使用0.1mL(浓度00-μg/mL)。
资料来源：康宁生命科学、merck生命科学
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