作者lWestwood
编辑l细胞房间
目前全球上市的抗体药物不下90个，而来源于体外抗体库筛选的抗体仅有10个（见附表）。究其原因，业界认为，首先，传统的抗体库构建方法采用的是轻重链随机配对，这种方式增加了库的多样性，但也破坏了抗体分子的天然状态，使得抗体分子的稳定性难以保证；其二，筛选到的scFv形式的抗体若要进一步做成药性研究，通常需要改造成IgG形式，而分子形式的转换会对抗体的亲和力和分子性质造成不确定的影响；其三，基于经典的体外抗体库筛选方法，前期的hits筛选是以抗体分子的亲和力为主要指标，分子的其他性质（折叠状态、稳定性、表达量等）的维护并没有在筛选策略的设计中被同时考虑。
因此，这些年来，工业界和学术界针对这个问题已经尝试了和正在尝试多种解决方法。小编认为，这些策略可以分为两类：一类是控制input，即保证抗体库中的抗体分子为轻重链天然配对的Fab或IgG形式的抗体；另一类是控制output，即将抗体性质的筛选融入到初步筛选过程中，确保筛选到的抗体具有良好的分子性质。
策略一：维持抗体轻重链的序列和配对的天然性（控制input）既然轻重链的错配会对抗体分子的性质产生可能的不利影响，那我们可以在筛选初期就确保轻重链的天然配对。以去年发表在《NatureBiotechnology》上的工作为例[1]，德州大学奥斯丁分校的GeorgeGeorgiou教授的实验室开发了一套基于微流控技术的轻重链天然配对的Fab形式抗体库的构建方法。
▲图1.基于微流控技术的Fab形式的抗体文库构建的流程
他们收集经过病毒疫苗免疫后的健康人的PBMCs，利用微流控设备将单个细胞包到单个液滴中，随后裂解细胞并利用包被有oligo(dT)的磁珠抓取单细胞的总mRNA，再通过overlapRT-PCR实现轻重链可变区相连（形成scFv形式的抗体文库）并引入酶切位点。之后，他们将PCR产物混合并通过两步克隆将scFv抗体文库构建到带有抗体恒定区并由双向启动子调控基因表达的酵母表面展示中，形成Fab形式的酵母表面展示抗体文库。该文库可用于后续的病毒广泛中和型抗体的发现等。基于这样将B细胞分选与轻重链天然配对的抗体库构建方法对接的策略，他们得到的抗体文库中的抗体分子为几乎完全的天然全人源。
策略二：将抗体分子性质的筛选融入初步筛选过程中（控制output）瑞士ETH的SaiT.Reddy教授的实验室8月份在《mAbs》上发表了一篇文章，介绍了他们利用CRISPR/Cas9系统将抗体库整合到经过改造的杂交瘤细胞的基因组上，从而实现IgG形式的抗体库在哺乳动物细胞系中的稳定表达和抗体分子筛选的结合[2]。
在前期的工作中，他们利用Cas9技术，将小鼠杂交瘤细胞系中的抗体κ轻链基因敲除，再将抗体重链基因替换成荧光报告基因mRuby，构建一个新的杂交瘤细胞系PnP-mRuby。本文的工作则是基于该细胞系，流程如图2。
▲图2.整合IgG形式的抗体文库到杂交瘤细胞系中，实现抗体库在哺乳动物细胞表面的展示
他们从经抗原OVA免疫的小鼠中分离骨髓浆细胞，通过反转录和PCR扩增获得各种抗体的重链和轻链基因。随后，他们将这些基因构建到一个由2A基因调控的双表达载体中（该载体能够实现抗体重链和轻链的同时表达），形成IgG形式的抗体文库。另外，他们在这个载体的一个同源臂片段的一侧设计了sgRNA的互补序列（如图3，该sgRNA同时用于后续的报告基因mRuby的剪切）。
▲图3.利用CRISPR/Cas9系统同时实现抗体文库基因的线性化和基因组整合
他们将抗体文库质粒和CRISPR/Cas9系统同时转入细胞，CRISPR/Cas9系统会同时实现文库质粒的线性化和细胞基因组（报告基因mRuby区域）的剪切，随后线性化的带有文库基因的片段作为双链的DNAdonor，通过HDR机制实现基因组的修复（同时将抗体文库表达体系整合到细胞基因组中）。
得到的稳定表达和展示抗体分子的杂交瘤细胞群可通过流式分选技术（FACS）实现抗体筛选。除了初始的抗体文库筛选，该体系也可以用于抗体的亲和力成熟（构建到载体中的抗体文库是基于特定抗体的突变库，整个实验流程相同）。
但利用哺乳动物细胞展示技术筛选高质量抗体分子这个策略并非该实验室首创，而是已经被研究多年。周辰博士在安进公司曾致力于开发抗体库的哺乳动物展示系统。年，周辰博士发表文章，介绍了他开发的快速构建用于哺乳动物细胞展示的抗体文库的方法[3]。他收集人的PBMCs，抽提总RNA并反转录，之后通过PCR扩增抗体重链和轻链基因，再通过酶切和连接将PCR产物分别构建到表达载体中，得到重链文库和轻链文库。他将带有抗体重链和轻链文库共转T细胞（若想获取稳转细胞，则利用抗生素进行加压筛选），再利用FACS检测抗体的表达情况和分选细胞。
▲图4.FACS检测抗体在T表面的展示情况
在后续的工作中，他的团队也开发了将抗体重链和轻链构建到同一载体中用于共表达的方法[4]，并在后续的工作中证明了他们的哺乳动物细胞展示技术的可行性[5]。另外，他们也在高多样性的抗体库的构建方面积累了丰富的经验。周博强调，将哺乳动物细胞展示用于抗体库的最后一步筛选，有助于我们得到以天然状态存在的成药性较好的抗体分子；同时，将CHO细胞作为本底细胞系并借助FACS筛选抗体，我们能够在筛选对抗原高亲和力的抗体的同时预测抗体分子在CHO细胞中的表达水平。周博基于这一套哺乳动物细胞展示技术创办的双展生物正在发展中。
在这一类的策略中，我们不需要特地控制初始的抗体的文库的所谓“天然性”，而是基于整个筛选系统来控制获得的全长抗体hits的成药所需的多种性质。前期的文库可以根据免疫文库构建，可以是突变文库，还可以是半合成或全合成文库，只要在后续的筛选过程中平行加入所需的评价指标，我们就能够确保hits的高质量。
小编总结
控制input和控制output这两种策略的逻辑完全不同，理论上都能够确保我们获得成药性较好的全长抗体分子。小编个人更倾向于控制output的策略。由于人的免疫系统的免疫耐受现象的存在，控制input的策略获得的抗体分子很难对人源靶点有高亲和力，这使得抗体开发工作基本仅限于针对外源病原体和内源性的突变抗原的抗体筛选，对于肿瘤和免疫疾病相关的诸多内源蛋白靶点难以有效。而控制output的策略只需通过筛选流程的设计，确保筛选得到的抗体分子具有足够的成药性，抗体库的构建方式没有严格限制，这鼓励了初始文库的多样性，为筛选到足够优秀的抗体分子提供了更大的可能。正如RichardA.Lerner教授所说，天然进化得到的抗体分子，仅仅代表它在目前的环境下是合理存在的，并不代表它是最好的。
参考文献
[1]WangB,etal.FunctionalinterrogationandminingofnativelypairedhumanVH:VLantibodyrepertoires.NatBiotechnol.,36(2):-.
[2]ParolaC,etal.AntibodydiscoveryandengineeringbyenhancedCRISPR-Cas9integrationofvariablegenecassettelibrariesinmammaliancells.MAbs.,11(8):-.
[3]ZhouY,etal.Anovelstrategyforrapidconstructionoflibrariesoffull-lengthantibodieshighlyexpressedonmammaliancellsurfaces.ActaBiochimBiophysSin(Shanghai).,42(8):-84.
[4]ZhouI,etal.Four-wayligationforconstructionofamammaliancell-basedfull-lengthantibodydisplaylibrary.ActaBiochimBiophysSin(Shanghai).,43(3):-8.
[5]LiCZ,etal.IdentificationofHBsAg-specificantibodiesfromamammaliancelldisplayedfull-lengthhumanantibodylibraryofhealthyimmunizeddonor.CellMolImmunol.,9(2):-90.
附表：已上市的基于体外抗体库的筛选得到的抗体分子
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