摘要：目的观察金水宝片对PM2.5致肺损伤大鼠的影响并对其机制进行研究。方法SD雄性大鼠60只，随机分为对照组、模型组及金水宝片低、中、高剂量（0.、0.、0.g/kg）组，每组12只。除对照组外，其余各组大鼠气管滴注PM2.5（10mg/kg）混悬液染毒，隔天1次，一周3次，连续4周，制备大鼠肺损伤模型。染毒结束后，除对照组、模型组外，其余各组ig给予相应金水宝片药液，1次/d，连续14d。观察各组大鼠一般状态；检查用力肺活量（FVC）、0.3秒用力呼出量（FEV0.3）、最大呼吸气流（PEF）；ELISA法检测肺泡灌洗液（BALF）中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、嗜酸性粒细胞（EOS）及肺脏匀浆中转化生长因子-β1（TGF-β1）的水平；HE染色观察肺组织病理学改变；Westernblotting检测肺组织中蛋白激酶B（Akt）、磷酸化-蛋白激酶B（p-Akt）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）以及人α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。结果与模型组比较，中、高剂量金水宝片均能提高肺损伤大鼠的FVC、FEV0.3、PEF、FEV0.3/FVC（P＜0.01），降低IL-6、TNF-α、EOS、TGF-β1水平（P＜0.05、0.01），显著改善大鼠肺组织病理学变化，降低大鼠肺脏中p-Akt、MMP-9、α-SMA表达（P＜0.05、0.01）。结论金水宝片对PM2.5导致大鼠肺损伤具有明显治疗作用，其作用机制可能与金水宝片通过PI3K/Akt信号通路减少炎症反应，延缓纤维化进展有关。
雾霾不仅对气候、环境、经济等方面造成严重影响，而且对人类健康也会产生严重的威胁[1]。雾霾的主要成分为PM2.5，PM2.5是指空气动力学当量直径≤2.5μm的细颗粒物，能随人体呼吸气流进入呼吸道下段，如细支气管，并能穿过肺泡，沉积在肺脏内，对人们的健康产生直接影响[2]。近年来研究发现，大气颗粒物可引发和加重多种呼吸系统疾病，直接引起咳嗽、呼吸困难、喘息等呼吸道症状，诱发或加重哮喘、支气管炎、肺脏损伤和/或纤维化、慢性阻塞性肺疾病等，对血液和生殖系统疾病也具有一定的影响[3]。有效干预PM2.5造成的健康风险已经成为我国医药研究领域的重大科学问题。金水宝方主要成分为发酵虫草菌粉，其化学成分与药理作用与天然虫草相似[4]。目前应用于临床的有金水宝片和金水宝胶囊2种剂型。大量临床用药与理论研究证明，金水宝对呼吸系统、心血管系统、泌尿生殖系统以及免疫系统等均具有明显临床疗效[5]。近年来有研究报道，金水宝可以延缓哮喘大鼠气道重塑的发生[6]，对尘肺大鼠具有改善全身及肺组织炎症反应、提高机体抗氧化应激能力，抵御肺组织纤维化的功效[7]，而其对PM2.5引起的肺损伤的功效尚未见报道。本研究通过气管滴注PM2.5生理盐水混悬液的方法制备肺损伤大鼠模型，并用金水宝片进行干预治疗，观察其对PM2.5致肺损伤模型大鼠的影响，探究金水宝片对肺功能、机体炎性反应、炎性因子的影响，为临床防治PM2.5致呼吸系统疾病提供一种新的治疗思路。
1材料
1.1实验动物
SD大鼠，雄性，SPF级，体质量～g，动物合格证号43；购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（湘）-；在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境饲养，使用许可证号SYXK（湘）-。
1.2药品与试剂
金水宝片（0.42g/片，每片含有0.25g发酵虫草菌粉，批号402），由江西济民可信金水宝制药有限公司提供；PM2.5混悬液自制（采集湖南省长沙市浏阳工业园区大气颗粒物PM2.5，经超声震荡脱颗粒，滤过、冷冻、真空干燥处理，取粉末用0.9%氯化钠溶液配制成20mg/mL混悬液）；大鼠白细胞介素-6（IL-6，批号209）、大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α，批号209）、大鼠转化生长因子-β1（TGF-β1，批号）酶联免疫试剂盒均购自Bio-Swamp公司；蛋白激酶B（Akt）抗体（货号-2-AP）、磷酸化-蛋白激酶B（p-Akt）抗体（货号-1-Ig）、β-actin（货号-1-Ig）均购自美国Proteintech公司；基质金属蛋白酶9（MMP-9，货号ab）抗体、人α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（货号ab）均购自英国Abcam公司。
1.3仪器
TSP-PM2.5粉尘颗粒采集器MJ-0A（北京明杰蓝天科技有限公司）；KQ-GTDV高频恒SPDP真空浓缩仪（美国Thermo公司）；BC-Vet型兽用五分类血液细胞分析仪（深圳迈瑞公司）；ML/P型多通道生理记录仪（澳大利亚埃德公司）；SpectraMaxi3x型多功能酶标仪（奥地利美谷光子公司）；DFCC病理成像系统、DFCC病理成像系统（德国Leica公司）；PowerPacTMBasic电泳仪（美国BIO-RAD公司）；JY04S-3C凝胶成像分析系统（北京君意东方公司）。
2方法
2.1分组、造模及给药
雄性SD大鼠60只，按体质量随机分成5组，分别为对照组、模型组及金水宝片低、中、高剂量（0.、0.、0.g/kg）组，每组12只。除对照组外，其余各组大鼠按0.5mL/kg经气管滴入PM2.5溶液（20mg/mL）进行染毒，对照组经气管滴注等体积0.9%氯化钠注射液，隔天1次，一周3次，连续4周。各组大鼠于造模结束后，每日给药前将金水宝片（研磨成粉）用蒸馏水配制成相应质量浓度药液，金水宝片低、中、高剂量组按10mL/kgig给予相应药液，对照组与模型组按10mL/kgig给予蒸馏水，1次/d，连续14d。
2.2肺功能检测
各组大鼠末次给药后称体质量，ip20%乌拉坦mg/kg麻醉，剪开颈部皮肤，钝性分离出气管，于气管近头部处剪一纵横均约1.0mm的T形切口，行气管插管，并用棉线固定，转移大鼠至体描仪平台，连接辅助呼吸机与气管接头，记录大鼠用力肺活量（FVC）、0.3s用力呼出量（FEV0.3）、最大呼吸气流（PEF）指标的变化，计算FEV0.3/FVC值。
2.3肺泡灌洗液和肺组织匀浆中指标测定
剥离气管及肺脏，结扎左主支气管，经气管注入0.9%氯化钠注射液7mL至右主支气管和右肺，回收约5mL灌洗液，血液细胞分析仪检测大鼠肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞（EOS）数目；将BALFr/min离心15min，ELISA试剂盒检测BALF中IL-6、TNF-α水平；取部分左侧肺脏，称质量后匀浆，r/min离心15min，取上清液，采用ELISA试剂盒检测上清液中TGF-β1水平。
2.4肺组织病理学观察
取左肺上叶，置于10%福尔马林固定液固定，制成石蜡切片，厚度为5μm，HE染色，在光学显微镜下观察肺组织的病理改变。
2.5肺脏组织中相关蛋白表达水平的测定
取右侧肺约0.g，用预冷PBS清洗组织，加入RIPA裂解液μL于匀浆器中反复研磨组织至看不见组织块，冰上蛋白裂解10min，4℃、10r/min离心15min，将离心后的上清分装转移至0.5mL离心管中，并进行蛋白定量。分别取50μg总蛋白上样，进行凝胶电泳，半干法转聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，以5%脱脂奶粉封闭1.5h。用多克隆一抗（兔抗大鼠Akt、p-Akt、MMP-9、α-SMA）与PVDF膜4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次15min。室温孵育HRP标记的二抗（Proteintech）90min，TBST洗3次，每次15min，ECL化学发光法曝光扫描拍照，用quantityone软件分析各组大鼠肺脏中Akt、p-Akt、MMP-9、α-SMA的蛋白相对表达量，并计算各组中相应蛋白与内参β-actin的相对比值。
2.6统计学分析
数据采用SPSS16.0软件分析，数据用表示，组间显著性差异比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），方差齐性者组间比较采用LSD检验，不满足方差齐性者采用Tamhane’sT2检验。
3结果
3.1对肺损伤大鼠一般体征的影响
与对照组比较，模型组大鼠染毒后后期出现呼吸急促、活动减少、皮毛无光泽；与模型组比较，各给药组大鼠的活动状态明显增加，呼吸症状明显缓解。
3.2对肺损伤大鼠肺功能参数的影响
与对照组比较，模型组大鼠的FVC、FEV0.3、PEF、FEV0.3/FVC显著减小（P＜0.01）；与模型组比较，金水宝片低剂量组大鼠的FVC、FEV0.3、PEF、FEV0.3/FVC无明显差异，金水宝片中、高剂量组大鼠的FVC、FEV0.3、PEF、FEV0.3/FVC显著增加（P＜0.01），见表1。
3.3对肺损伤大鼠肺脏病理学改变的影响
如图1所示，对照组肺脏组织切片可见肺泡壁结构正常，间质未见炎症细胞浸润，肺泡腔内未见明显的渗出物；模型组可见脏局灶性肺泡腔变小、肺泡壁增生、肺泡完整性倍破坏，周围大量炎症细胞浸润；金水宝片低剂量组可见肺泡壁增厚，金水宝片中、高剂量组可见肺泡间隔增厚程度明显减少，肺泡腔体积明显变大，肺间质和肺泡腔内炎性细胞浸润明显减少。
3.4对肺损伤大鼠BALF中炎症反应相关指标的影响
与对照组比较，模型组大鼠BALF中IL-6、TNF-α、EOS水平显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，金水宝片低剂量组大鼠BALF中的IL-6、TNF-α、EOS无明显差异，金水宝片中、高剂量组大鼠BALF中IL-6、TNF-α、EOS水平显著降低（P＜0.05、0.01），见表2。
3.5对肺脏纤维化相关指标的影响
与对照组比较，模型组大鼠肺组织匀浆中TGF-β1水平以及MMP-9和α-SMA蛋白表达水平显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，金水宝片低剂量组大鼠肺脏中的TGF-β1水平以及MMP-9和α-SMA蛋白表达水平均无明显差异，金水宝片中、高剂量组大鼠肺组织匀浆中的TGF-β1水平以及MMP-9和α-SMA蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）。见表3和图2。
3.6对肺损伤大鼠肺脏Akt蛋白表达的影响
与对照组比较，模型组大鼠肺脏中Akt蛋白表达水平无显著变化，p-Akt蛋白的表达水平显著增强（P＜0.01）；与模型组比较，金水宝片低剂量组大鼠肺脏中p-Akt的蛋白表达水平无明显差异，金水宝片中、高剂量组大鼠肺脏中p-Akt蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。结果见图3和表4。
4讨论
空气中的PM2.5随人呼吸气流进入呼吸道，并沉积在肺脏内，对呼吸系统造成损伤[2]。研究显示PM2.5对肺组织病理学影响主要表现为炎性改变，严重者可引起肺纤维化，肺间质有大量的炎性细胞浸润，肺间隔增厚，毛细血管受损，细支气管和毛细血管周围亦有大量的炎性细胞浸润[8]。本实验采用气管滴入PM2.5混悬液复制PM2.5致肺损伤模型，病理观察结果显示，与对照组比较，模型组动物肺脏组织中炎性细胞浸润严重，肺泡结构完整性被破坏，肺泡壁增等，提示造模成功。与模型组比较，金水宝片低剂量组可见肺泡壁增厚，金水宝片中、高剂量组可见肺泡间隔增厚程度明显减少，肺泡腔体积明显变大，肺间质和肺泡腔内炎性细胞浸润明显减少，这表明金水宝片明显缓解了PM2.5所致的病理损伤；与此同时，气道检测结果显示，金水宝片组的FVC、FEV0.3、PEF、FEV0.3/FVC均较模型组有明显上升，提示金水宝片具有增强肺损伤大鼠肺功能的作用。
研究发现，PI3K/Akt信号传导通路在炎症的发生、发展中起着至关重要的作用，PI3K属于信号转导酶家族，Akt是PI3K的下游产物，经信号传导后，通过活化肺泡上皮细胞释放多种炎症因子与促纤维化生成因子，如TNF-α、IL-6以及TGF-β1、MMP-9和α-SMA等。TGF-β1可加速成纤维细胞转化为肌成纤维细胞[9]，同时大量炎症因子通过异常活化α-SMA诱导肺脏胶原沉积，促进肺纤维化形成[10]。与此同时，MMP-9可能通过降解肺组织中的弹性纤维造成肺组织弹性支持作用减低，而且MMP-9降解的细胞外基质片段对炎性细胞还有趋化作用，可放大肺组织局部的炎性反应，进一步加重肺实质的毁损[11]。本研究结果显示，PM2.5染毒大鼠BALF中TNF-α和IL-6的水平显著升高，肺脏组织中TGF-β1的水平以及MMP-9、α-SMA的蛋白表达均显著上升，金水宝片干预治疗后，大鼠肺脏组织中TGF-β1的水平显著减少，MMP-9、α-SMA表达显著下降，BALF中TNF-α和IL-6显著降低，提示金水宝片能够调控炎症因子的释放，减轻PM2.5所致的大鼠肺部炎性损伤，还能通过对TGF-β1、MMP-9、α-SMA的影响，调控肺脏损伤所致的肺纤维化进程。同时金水宝片还能显著降低模型大鼠肺脏中p-Akt蛋白表达，且上述炎症因子与纤维化因子的变化均与p-Akt的表达密切相关，，提示金水宝片能通过PI3K/Akt信号传导通路影响PM2.5诱导的肺脏炎症反应和纤维化进程。
综上所述，金水宝片能改善肺脏通气功能，减轻肺脏病变，对PM2.5所致的呼吸系统损伤具有明显治疗作用，其作用机制可能与金水宝片通过PI3K/Akt信号传导通路减少炎症反应，延缓纤维化进展有关。
参考文献（略）
来源：夏伟，刘学武，王小青，陈志雄，信红亚.金水宝片对PM2.5致大鼠肺损伤的保护作用及其机制研究[J].中草药,,50(13):-.
