孟丽华 薛荣亮 杨毅猛 雷晓鸣党莎杰
，西安交通大医院麻醉科（孟丽华、薛荣亮、杨毅猛、雷晓鸣）；西安，医院麻醉科（党莎杰）
国际麻醉学与复苏杂志,,38(08):-.
DOI：10./cma.j.issn.-..08.
基金项目：国家自然科学基金（）
ORIGINALARTICLES
本研究小组前期研究通过丙氨酸替代的方法制备了更高效的穿膜肽4型（PTD4），并在国内外首次获得了蛋白质转导4型-铜锌超氧物歧化酶融合蛋白（PTD4-Cu，Zn-SOD）。因人源神经元难以在体外保持稳定性状传代培养，而人星形胶质细胞具有与神经元相似的形态和生理特征，因此，本研究在课题组之前研究的基础之上，通过观察检测人星形胶质细胞内的荧光蛋白的分布情况，进一步评估PTD4-Cu，Zn-SOD的穿膜能力，及其在细胞内的生物学活性。
1 材料与方法
1.1 主要材料
人星形胶质细胞，Cu，Zn-SOD和PTD4-Cu，Zn-SOD（由本课题组自主研发），细胞培养基（DMEM），15%胎牛血清，1∶胰酶（Amresco），抗HIS标签抗体，山羊抗鼠二抗，抗Beta-actin标记抗体，蛋白标记，Immobilonwestern发光试剂盒，AnnexinV/PI凋亡测试盒。
1.2 方 法
1.2.1 细胞传代与培养
人星形胶质细胞培养瓶置于倒置显微镜下观察，融合率达70%~80%以上开始传代,置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养。
1.2.2 Westernblot
1.2.2.1 时间干预
取同一代来源的细胞，按完全随机对照法分对照组、SOD组、PTD4-Cu，Zn-SOD组（PTD4-SOD组）3组，每组6瓶细胞，待细胞再次生长至80%左右，去除旧培养基，PBS洗两遍，加入干预措施。
对照组加入DMEM培养基，SOD组加入Cu，Zn-SOD终浓度为2μmol/L的DMEM培养基，PTD4-SOD组加入PTD4-Cu，Zn-SOD终浓度为2μmol/L的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2孵箱内培养。每组细胞分别共培养10、15、20、30、45、60min后Westernblot检测蛋白。根据以上预实验结果将3个组的时间分组缩短为15、30、60min3组，提取细胞裂解上清后，蛋白电泳，特异抗体孵育，Westernblot分析。
1.2.2.2 浓度干预
取同一代来源的细胞，按完全随机对照法分对照组、SOD组、PTD4-SOD组，每组4瓶细胞，待细胞再次生长至80%左右，去除旧培养基，PBS洗两遍，加入干预措施。
对照组加入DMEM培养基，SOD组4瓶细胞依次加入Cu，Zn-SOD终浓度为0.25、0.50、1.00、2.00μmol/L的DMEM培养基，PTD4-SOD组四瓶细胞依次加入PTD4-Cu，Zn-SOD终浓度为0.25、0.50、1.00、2.00μmol/L的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2孵箱内培养。终止培养及消化、离心、细胞裂解、提取上清的方法同时间干预组的相关处理，提取各组细胞裂解上清中蛋白进行考马斯亮蓝染色。重复上述实验，根据预实验结果将浓度分组改为0.5、1.0、2.0μmol/L3个浓度梯度进行Westernblot分析。
1.2.3 流式细胞术检测凋亡
星形胶质细胞以1×/ml的密度接种于6孔板，实验分缺氧对照组、SOD组、PTD4-SOD组3组，待细胞贴壁生长36h后，全部更换为含氯化钴终浓度为μmol/L的DMEM培养基（不含血清），置于37℃、5%CO2孵箱内培养24h后终止缺氧，去除旧培养基，PBS洗两遍，给予融合蛋白干预：对照组更换为DMEM培养基（不含血清），SOD组细胞加入Cu，Zn-SOD终浓度为2μmol/L的DMEM培养基（不含血清），PTD4-SOD组加入PTD4-Cu，Zn-SOD终浓度为2μmol/L的DMEM培养基（不含血清），将所有细胞置于37℃、5%CO2孵箱内培养1h。用流式细胞仪检测。
2 结果
2.1 考马斯亮蓝染色结果
2.1.1 时间梯度
结果提示，PTD4-SOD组随着干预时间的不断延长存在疑似条带，而SOD组没有（图1）。
2.1.2 浓度梯度
结果提示，PTD4-SOD组随着干预浓度的增大出现疑似条带，而SOD组没有（图2）。
2.2 Westernblot检测结果
2.2.1 时间梯度
结果提示，PTD4-SOD组在干预时间为60min时可以穿膜进入细胞，而SOD组增加干预时间仍不能穿膜（图3）。
2.2.2 浓度梯度
结果提示，PTD4-SOD组在干预浓度为2μmol/L时可以穿膜，而SOD组增加干预浓度仍不能穿膜（图4）。
2.3 流式细胞术检测凋亡
结果提示，PTD4-SOD组与SOD组两组与对照组比较均表现出了抗凋亡现象，但PTD4-SOD组细胞凋亡减轻更为显著（表1）。
3 讨 论
3.1 融合蛋白PTD4-Cu，Zn-SOD可以穿膜
实验结果表明：融合蛋白PTD4-Cu，Zn-SOD在体外培养的神经胶质细胞中可以成功穿膜；体外培养的星形胶质细胞中融合蛋白PTD4-Cu，Zn-SOD的量随着与细胞孵育时间和蛋白浓度的增加而增加，在一定范围内呈现出剂量依赖性、时间依赖性的特点；而Cu，Zn-SOD不能穿过人星形胶质细胞的细胞膜，无论增加孵育时间还是蛋白浓度均不能穿膜。用基因工程方法制备的PTD4-Cu，Zn-SOD能够进入细胞内，无需细胞内分子伴侣的作用，而且方法简单可行。
3.2 融合蛋白PTD4-Cu，Zn-SOD可以降低人星形胶质细胞缺氧损伤所致的细胞凋亡
流式细胞术是当代最先进的细胞分析定量技术之一。由实验结果可以看出，SOD组和PTD4-SOD组与对照组比较，细胞凋亡率均有降低且差异均有统计学意义，但PTD4-SOD组的细胞凋亡率降低的更为显著，与SOD组比较差异仍有统计学意义。因此推论Cu，Zn-SOD和融合蛋白PTD4-Cu，Zn-SOD对星形胶质细胞缺氧损伤呈负相关趋势，有保护作用，后者的保护作用更明显，也间接说明融合蛋白PTD4-Cu，Zn-SOD可以进入细胞，发挥生物活性作用。
国际麻醉学与复苏杂志
主管：中华人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
主办：中华医学会徐州医科大学
ISSN：-CN:32-/R
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