备受期待的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒名单终于公布了，“原博士带你做检测”准备了一些非瘟抗体ELISA知识点，能让大家在被口吐莲花的销售代表忽悠时保持一颗平常心。
一、非瘟病毒ELISA抗体检测盒的原理
33个非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中有3种类型的ELISA，分别是间接ELISA（17个），阻断ELISA（12个）和夹心ELISA（4个）。依据的是国标《非洲猪瘟诊断技术》(GB/T-)中的三种ELISA抗体检测方法。
1.间接ELIS
间接ELISA通常用于测定血清中IgG抗体，理论上也可以检测IgM抗体，但是IgM抗体通常使用捕获ELISA来检测。间接ELISA是应用最广泛的ELISA方法，由于只要获得抗原，配合通用的酶标抗猪IgG的二抗就可以快速建立ELISA方法。产品性能取决于抗原的纯度，抗原纯度不够会导致非特异IgG的结合，产生假阳性。
实验流程通常为：
1）准备好包被了已知定量的抗原的ELISA板。
2）加样：加待检测的样品。温育反应一定时间，如果血清中含有针对包被抗原的抗体，则待检抗体与固相抗原发生特异性结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物质。
3）加酶标二抗：加入酶标抗抗体（二抗），该酶标二抗与抗原抗体复合物结合形成抗原—待测抗体—酶标二抗的复合物，温育，洗涤。
4）显色：加入底物溶液，温育一定时间后，固相上酶的催化底物产生有色产物，颜色深浅与抗体量成正比。
5）终止：加入终止液终止显色反应。
6）读数：使用酶标仪测定各孔光密度值（OD值）。
2.阻断ELISA/竞争ELISA
阻断ELISA/竞争ELISA通常用于测定血清中IgG抗体。阻断ELISA/竞争ELISA需要抗原和特异性的单抗或多抗。对抗原的纯度要求不高，产品的性能取决于单抗或多抗的特异性和亲和力。背景干扰低，特异性高。
实验流程通常为：
1）准备好包被了已知定量的抗原的ELISA板。
2）加样：加待检测的样品。温育反应一定时间，如果血清中含有针对包被抗原的抗体，则待检抗体与固相抗原发生特异性结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物质。
3）加竞争抗体：加入酶标单抗或多抗，该酶标单抗或多抗与待测样品竞争性与包被抗原结合，形成抗原—酶标抗体的复合物，温育，洗涤。
4）显色：加入底物溶液，温育一定时间后，固相上酶的催化底物产生有色产物，待检抗体越多，颜色越浅；待检抗体越少，颜色越深。
5）终止：加入终止液终止显色反应。
6）读数：使用酶标仪测定各孔光密度值（OD值）
3.双抗原夹心ELISA
双抗原夹心ELISA用于测定血清中IgM、IgG、IgA等总抗体。技术难度最高，需要制备高质量的酶标抗原。该方法不受非特异性IgG的干扰，背景干扰小，敏感性和特异性高。
实验流程通常为：
1）准备好包被了已知定量的抗原的ELISA板。
2）加样：加待检测的样品。温育反应一定时间，如果血清中含有针对包被抗原的抗体，则待检抗体与固相抗原发生特异性结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物质。
3）加酶标抗原：加入酶标抗原，该酶标抗原与抗原抗体复合物结合形成抗原—待测抗体—酶标抗原的复合物，温育，洗涤。
4）显色：加入底物溶液，温育一定时间后，固相上酶的催化底物产生有色产物，待测样品中抗体含量越高，颜色越深。
5）终止：加入终止液终止显色反应。
6）读数：使用酶标仪测定各孔光密度值（OD值）。
二、用于非洲猪瘟病毒抗体检测的常用蛋白
根据文献中报道具有诊断学意义的蛋白主要有P72（VP73）蛋白、P54蛋白、P30（P32）蛋白、PP62（P60）蛋白。
1.P72（VP73）蛋白结构蛋白，由BL基因编码，分子量约为73.09kDa。VP73在大多数毒株中相当稳定，能与所有感染猪的血清发生免疫学反应，且其抗原性非常稳定。该蛋白是血清学诊断方法的理想抗原，常被用于抗体检测。2.P54蛋白结构蛋白，由EL基因编码，大小约25kDa。在病毒感染的早期阶段发挥作用，是病毒的复制必需蛋白。P54蛋白具有较好的免疫原性，其产生的抗体能够阻断病毒颗粒粘附到易感细胞上，该蛋白较为保守，产生的抗体在体内出现时间早，持续时间长。3.P30（P32）蛋白主要结构蛋白，由CPL基因编码，在病毒感染的早期表达，可用于ASF感染早期诊断。4.PP62（P60）蛋白由CPR基因编码，在病毒复制晚期表达，经过加工生成P35蛋白和P15蛋白。用于ASFV抗体检测的抗原及其作用
可能会有很多人开始纠结于到底选择包被哪种蛋白的试剂盒，个人觉得对于ELISA试剂盒来说，蛋白选择固然重要，但是试剂盒的生产工艺对试剂性能的影响更大。
三、非洲猪瘟病毒抗体消长
根据ReisAL试验数据，EL/p54,KR,AR/histone-like和BL抗体反应强，14天IgG抗体%转阳，持续39天以上。BL/p73,CPL/p32,CPR,NPL/DNAligase和FL抗体反应中等，14天IgG抗体未%转阳，但可以检测到。KR,K78R/p10和C44L抗体较弱。。
ASFV12种蛋白的IgG抗体
EL/p54,KR,AR/histone-like和BL四种蛋白的IgM抗体7天可以检测到，14天开始下降。ASFV4种蛋白的IgM抗体
四、抗体检测的确诊方法
ELISA虽然简单易得，但是ELISA应用于筛查检测时仍然会出现假阳性和假阴性的结果。那么用什么方法去作为ELISA方法的确诊方法呢？（以某个品牌的所谓进口试剂盒去评价其他ELISA试剂盒的方法是错误的）
根据OIE陆生动物手册，可以使用间接免疫荧光（indirectfluorescentantibody，IFA）、间接免疫酶（indirectimmunoperoxidasetest，IPT)）和免疫印迹（immunoblotting，IB）的方法作为ELISA实验的确诊方法。
（Themost
