随着工业的快速发展和人民生活水平的提高，能源需求急剧增加。由于化石资源的不可持续性以及使用造成的环境污染等问题，促使人们挖掘新型绿色清洁能源来替代现有的化石资源。近年新型发展的洁净能源除了风能、太阳能和潮汐能以外，生物质能源由于原料廉价、分布广泛的优势，备受到人们的重视。生物乙醇以一定比例与汽油混合作为汽车燃料已经得到很好的应用，03全球生物乙醇产量便已经达到万m3，联合国粮农组织预测0年生物柴油将占到主要发达国家能源消耗的40%以上，但以玉米、甘蔗等农作物作为生产原料的第一代生物燃料，所造成对粮食的需求急剧增加同时引起玉米等大宗商品的价格升高，因此以木质纤维素原料、草本作物等非粮食性原料生产生物乙醇的第二代生物燃料备受青睐。木质纤维生物质原料非常丰富，除已有木质纤维素的储备量以外，通过光合作用每年新生成木质纤维类生物质资源就高达亿吨，而每年用于工业过程或燃烧转化为热量的纤维素仅占总量的%左右，有大量的木质纤维生物质未被有效利用。
一般来说，以木质纤维生物质为原料制备生物乙醇主要需经过预处理、水解、发酵和蒸馏4个关键流程，预处理是对通过对植物细胞壁的复合结构一定程度地破坏，使其三大主要成分纤维素、半纤维素、木质素一定程度地粉碎，变得易于溶解和分离。其实，预处理即对木质纤维素材料进行初步的处理，主要目的是降低纤维素的分子质量，打开其密集的结晶区，以利于进一步的分解和转化。水解即通过纤维素酶将纤维素水解为微生物可以直接利用的单糖，但早在0世纪80年代就发现存在木质纤维素原料中的木质素对纤维素酶具有抑制作用。木质素在酶解底物中的存在既可作为物理屏障，阻碍纤维素酶与纤维素的充分接触，其本身又能够吸附纤维素酶，导致木质素与纤维素酶之间产生非反应性的结合，而且木质素的含量和结构类型对不同的木质素水解底物产生不同程度的影响。近年来大量的关于木质素的研究以期望弄清木质素抑制纤维素酶的作用机理，并试图寻找能够削弱甚至消除木质素对于纤维素酶这种不利影响的办法。
木质素对纤维素酶的抑制机理木质素是构成植物细胞壁的主要成分，含量仅次于纤维素、半纤维素，是自然界含量最高的芳香族聚合物。木质纤维素原料中的木质素的存在不仅会在物理上阻碍纤维素酶对纤维素的水解效率，还会通过疏水作用、静电作用、氢键作用会与纤维素酶产生非生产性吸附，使大量纤维素酶失去水解能力，致使需要添加额外的纤维素酶抵消掉被木质素结合的负面影响，纤维素酶的额外添加无疑会造成生产成本的升高。
、木质素对纤维素酶的物理屏障作用有研究发现在水蒸气预处理木质纤维素的工程中，随着预处理程度的增加纤维素的酶解程度会增加，原因被认为是随着蒸汽预处理程度的增加木质素在木质纤维原料植物细胞壁中的分布被打乱，从一定程度上破坏了原有的结构，从而增加纤维素酶在纤维素上的可及性。稍早前有研究发现用碱预处理木质纤维素会造成纤维素水解效率的降低，碱预处理对木质素的再分布产生的影响为纤维素水解提供了负能量，尽管底物中的木质素的含量在碱预处理后是总体下降的，但是底物的酶解效率也是下降的，预处理虽然在一定程度上会降低木质素的含量，但预处理后也同样造成木质素从纤维壁上转移到纤维表面，从一定程度上对纤维素酶与纤维素结合造成了物理上的阻碍。而且木质纤维素原料中的木质素与纤维素及半纤维素不是一种无关联的存在，存在一部分木质素-碳水化合物复合体（LCC），有研究发现LCC会在物理层面阻碍纤维素酶嵌入植物细胞基质，木质素的含量越高复合物的含量也会越高，而且木质素含量相同的前提下，S单元与V单元比值越高的情况下，会造成更多的木质素糖类复合物。此外，预处理程度如果不充分，木质素大量残留的情况会抑制木质纤维素的溶胀，底物中的孔隙会因而减少，同时又由于木质素本身具有疏水性，木质素的大量残留会导致木质纤维素整体的亲水性降低，在水中的溶胀度也减小，有研究通过绿液预处理后，使得木质素的含量降低，同时造成木质纤维素原料表面积提高并增大了空隙的体积和大小，使最终的水解效率得到极大提升，间接证明了木质素在物理层面对水解产生的阻碍作用。
、木质素对纤维素酶的无效吸附木质素除了因为物理屏障作用降低纤维素酶在纤维素上的可及性之外，还会由于纤维素酶在木质素上产生无效吸附而减小木质纤维素的酶解效率。研究发现外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶均与木质素存在吸附关系[8]。纤维素酶在木质素上发生无效吸附的作用主要被推测为疏水作用、静电作用和氢键作用。但是，纤维素酶和木质素之间的相互作用方式以及其对木质纤维素的酶解的抑制作用的机理至今尚不清楚。有研究认为疏水作用在纤维素酶和木质素之间起到主导作用。当纤维素酶在反应底物中舒展时，酶表面的疏水区域会与木质素的疏水基团相结合，而纤维素酶的水解纤维素的活性中心便位于疏水区域，从而木质素的结合使纤维素酶丧失了水解纤维素的能力。而且有研究发现木质素相对于木质纤维素底物疏水性更强，所以木质素更易于纤维素酶结合。
一般而言，蛋白质酶是带有电荷的，由于可能同时带有羧酸，氨基，磷酸等基团，在酸性条件下和碱性条件下会显不同的电荷，由于纤维素酶的酶解条件是酸性，有研究得出在酸性条件下大多纤维素酶显正电，而木质素在酸性条件下显负电，所以在酸性条件下木质素极易与纤维素酶结合。也有研究证明纤维素酶和木质素之间存在氢键作用，在植物细胞中，木质素上的羧基和酚羟基以及甲氧基易与水形成氢键，是纤维素酶和木质素氢键结合的原因。
减少木质素对纤维素酶抑制作用的方法木质素对纤维素酶的抑制作用，从上文的论述可以得出，无外乎木质素从物理阻碍作用和无效吸附作用这两大因素对纤维素酶产生抑制作用，而能够使得抑制作用得到改善的方法，只能从改变预处理条件、纤维素酶的反应条件以及木质素的结构入手，相关研究很多，归纳总结如下：
.改变纤维素酶的反应条件..改变反应温度
Lu等通过在预处理阶段使用热水，导致木质素分子量增大，而且使木质素的分散性降低，分子活性降低，疏水性官能团发生改变，从而大大降低木质素与纤维素酶由于疏水作用产生的无效吸附。Zheng等同样通过调整反应温度入手，通过改变反应过程的温度，发现当反应温度升到50°C时，木质素对纤维素酶的吸附平衡时间从4°C时的h变为h，并且50°C时纤维素酶与纤维素的结合能力提高。综上所述，高温状态下有助于降低木质素的分散性，同时使木质素与酶之间的疏水相互作用降低，又能够增强纤维素酶和纤维素的结合能力。
..改变反应pH值
Rahikainen等发现当使反应底物的pH值增大时，木质素与纤维素酶的结合度降低，通过使反应底物的pH值增大从而致使底物的阴离子浓度升高，造成木质素在与纤维素酶静电结合时形成竞争作用，从而降低了木质素与纤维素酶的结合度。此外，Lou等研究发现提高pH值可以显著提高木质素分子的表面带电量，这使得木质素水溶性提高，这样就减少了其与纤维素酶的疏水性结合。总之，一定程度地提高pH值可以削弱木质素对纤维素酶的吸附作用。
..3改变预处理手段
不同的预处理也会影响到木质素与纤维素酶的吸附关系，Gao等发现通过酸进行预处理会导致底物中的残留木质素与纤维素酶之间产生更多的非生产性吸附，从而使更多的纤维素酶丧失了水解纤维素的能力，而且这个过程是不可逆的，但通过离子液体预处理使得纤维素酶具有更好的酶恢复能力。有研究通过绿液预处理后，使得木质素的含量降低，同时造成木质纤维素原料表面积提高并增大了孔隙的的体积和大小，使最终的水解效率得到大幅度提升。
..4不同添加剂在反应底物中的应用
为了提高酶水解效率，有很多关于通过在反应底物中使用一些添加剂，从一定程度上缓解木质素与纤维素酶的非生产性吸附的报道。Li等以及Jin等发现通过在反应底物中添加吐温80可以起到缓解木质素对纤维素酶的吸附作用。同样Lin等发现通过添加聚乙二醇（PEG）同样可以缓解木质素对纤维素酶的吸附作用，PEG可以与纤维素酶形成较小的聚合物，可以较均匀的分散到整个体系，避免了木质素吸附大量纤维素酶，而又絮聚在一起造成水解效率降低。Cai等的研究则更为细致，研究发现PVP-可以有效提高纤维素酶的水解效率减少非生产性酶的产生，而且要优于PEG、吐温-80以及牛血清蛋白，与PEG-相比，PVP-在木质素上的吸附规模更大，且稳定性及亲水性也更优异。添加剂的加入虽然会一定程度上降低木质素与纤维素酶的结合，但是添加剂的加入时间与添加方式对水解效果影响较大。Qin等的研究发现木质素与纤维素酶的结合是不可逆的，通过加入吐温-80、牛血清蛋白、氯化钙等添加剂有时对水解并没有起到改善作用。添加剂加入的最佳时间应该在预处理后还未加入纤维素酶时，而不能等到纤维素酶与木质素形成不可逆性吸附后再加入。
还有大量研究在酶水解体系中尝试了一些新颖添加剂的开发和使用，并得到了显著效果。Cai等发现添加聚乙烯吡咯烷酮可以提高纤维素酶的水解效率，降低非生产性纤维素酶的消耗量。Pielhop等发现在预处理时通过加入-萘酚可以提高纤维素酶的水解效率，减少了木质素与纤维素酶的非生产性结合。Cai等[33]研究发现在亚硫酸预处理的前提下溴化十六烷基甲烷（CTAB）与木质素磺酸钠（SL）共同作用可以增强纤维素酶的水解效率，首先CTAB的存在增强了SL对于木质素的吸附作用，且增大了纤维素酶与木质素之间的位阻，从而降低了木质素与纤维素酶的非生产性吸附。Akimkulova等通过添加Mg+与木质素的负电区域结合，从而削弱静电作用和氢键作用造成的木质素与纤维素酶的吸附。Tang等研究发现从酵母菌酶解的上层清液当中获得一种蛋白，该蛋白可与纤维素酶在与木质素结合上存在竞争关系，从而可以使得纤维素酶避免与木质素结合从而提高水解效率。Jin等近年的研究成果表明，水溶性木质素的添加对绿液预处理、碱预处理木质素纤维素的纤维素酶水解均具有促进最用，但在不含木质素的纯纤维素中的添加并未见促进作用。尽管目前水溶性木质素对酶水解促进作用的机理尚不明确，但这一结果给酶工学以及木质纤维生物质炼制均提出了新的研究方向。
.3改性纤维素酶纤维素酶与木质素所产生的非生产性吸附，很大程度上与纤维素本身疏水作用和所带正电与木质素带负电产生的静电结合有关，所以在不改变酶的活性中心的基础上，对纤维素酶进行改性规避木质素对纤维素酶的吸附作用将会提高酶水解效率。Nordwald等通过琥珀酰化纤维素酶在对纤维素酶的空间结构影响不大的前提下，使得纤维素酶的表面具有更多的阴离子从而使其与显负电性的木质素产生排斥作用，削弱了木质素对纤维素酶的吸附作用。
.4改变木质素在底物中的存在方式.4.分解木质素
从使用木质纤维素为原料发酵制备生物乙醇角度来说，木质素本身无法转化成乙醇，而且又会对纤维素酶产生非生产性吸附，其存在是对水解的最大障碍，所以若可以去除反应底物中的木质素就可以减少木质素对纤维素酶的非生产性吸附，从而提高纤维素酶的水解效率。Chang等研究发现种从土壤中筛选的芽孢杆菌CS-和CS-能够产生漆酶，该酶可以分解碱木素从而消除木质素对纤维素酶的吸附作用，如果配合乳酸菌使用还可以消除半纤维素对纤维素酶水解能力的影响。
.4.改变木质素结构
木质纤维生物质中，木质素作为三大主要成分之一，含量约占植物细胞壁总量的三分之一，在酶水解制备生物乙醇的过程中木质素起阻碍作用。因此，木质纤维素为原料的生物乙醇制备虽然研究开发了很久，但在经济核算上与粮食作物玉米等原料相比无法占优势，因而阻碍了木质纤维为原料的生物乙醇的推广和商业化进程。如果能够开发一种木质素的高值利用途径或通过改性木质素提高纤维素的酶解效率，将会进一步推动木质纤维素资源全组分利用的工业化。Nonaka等通过在木质素苄基位置上导入酚类物质得到改性木质素衍生物—木质素酚，然后将木质素酚与滤纸复合后，再用来固定纤维素酶，由于木质素酚与纤维素酶的结合能够保留酶的活性，在生物乙醇的商业生产过程中，酶的生产成本占了很大的比重，而该方法通过对纤维素酶进行固定化，使得纤维素酶在纤维素水解过程中可以被重复利用，从而降低了生产成本。Uraki等[44]的研究发现聚乙二醇缩水甘油醚（PE）作为交联剂与乙酸木质素（AL）能形成一种两性分子PE-AL，该分子可以与纤维素酶形成一种复合物，间接提高纤维素酶的活性，而且可以回收重复利用多次仍存在活性。Wang等发现木质素磺酸盐的加入促进了纤维素酶的水解作用。同时，Lou等发现通过在反应底物当中添加像木质素磺酸盐这样的线性阴离子芳香族聚合物，与木质素形成竞争关系，从而使木质素不易与纤维素酶相结合，但同样存在纤维素酶不易与纤维素结合的缺点，但配合AL-PCG使用可以提高酶的水解效率。
3总结与展望清洁能源将是未来世界能源结构的重心，作为可以部分替代石油资源的生物乙醇也将会受到极高的重视，而以木质纤维素为原料开发的第二代生物燃料能否真正实现工业化将是未来木质纤维生物质生物炼制能否真正成功的关键问题之一。木质素如果与酶解底物不进行彻底的分离，它会对纤维素酶产生无效吸附，这样欲达到相同的水解效果势必消耗更多数量的酶，使得木质纤维素为原料的生物乙醇制备成本高于现有石油原料。适当的预处理或添加一些酶解助剂，虽然对酶水解效率有所提升，但目前阶段的研究均是以牺牲成本为代价的研究，真正的工业化规模仍做不到。另外，影响添加的助剂如何影响酶水解的机理尚不完全明确。因此，单纯从如何提高酶的水解效率的角度去考虑生物质全组分的利用，或去考虑以木质纤维为原料的生物乙醇的工业化是行不通的。在以经过适当预处理分离出半纤维素、木质素的原料为底物，去水解制备生物乙醇的同时，在半纤维素和木质素上分别考虑其高附加值产品的开发，将会对木质纤维全组分的工业化利用及生物质炼制经济性的提高提供可能。
（南京林业大学江苏省制浆造纸科学与技术重点实验室）
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