采用CM-纤维素离子交换剂柱层析，以梯度洗脱方法从植物组织中分离和纯化酯酶。
1.仪器设备
玻璃层析柱、分光光度计等。
2.操作方法
1）粗酶制剂的制备
2）CM-纤维素离子交换剂的处理：称10gCM-纤维素干品置于烧杯中，加入ml0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液，混匀，静置10min后放入布氏漏斗抽滤，水洗滤渣至中性。再将滤渣悬浮于ml0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液中，混匀，静置15min后放入布氏漏斗抽滤，水洗滤渣至中性。最后将滤渣悬浮于所选择的起始缓冲液中。
3）层析柱的安装与平衡：取1.5×40cm的玻璃柱，以CM-纤维素装柱约30cm，用起始缓冲液平衡10h左右。
4）加样和梯度洗脱：用滴管将4ml粗酶制剂溶液（总蛋白质含量15mg）沿柱内壁徐徐加到纤维素柱面，然后慢慢放松下端螺旋夹，使样品液面降至纤维素柱表面，再加入少许洗脱起始缓冲液洗涤柱壁，如上操作，反复进行2次。
以5×10-3mol/L～1×10-1mol/LpH6.0磷酸缓冲液（各ml）作直线梯度洗脱。流速控制在2ml/20min。以部分收集器收集，每管收集2ml流出液。实验在0～10℃的温度范围内进行。测定各管流出液的酶活性，同时用Folin-酚法测定每管流出液的蛋白质含量。
5）酯酶活性的测定：底物乙酰-2，6-二氯酚靛酚经酯酶水解后生成2.6-二氯酚靛酚，在pH8.0条件下显蓝色，底物浓度恒定时，酶促反应速度取决于酶的活性。取4ml5×10-2mol/L的磷酸缓冲液（pH8.0），加0.2ml底物（最终浓度为1.25×10-4mol/L），再加适量酶溶液（0.5ml含μg蛋白质）和水，使反应系统的最终容积为6ml，在30℃下反应5min后立即在nm处测定吸收（A）值。6）结果处理
（1）以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，以相应流出液的蛋白含量为纵坐标，作出洗脱曲线图。蛋白质含量以1ml梯度洗脱液（Folin-酚试剂法测定）在nm处比色的光吸收值表示。
（2）以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，以相应流出的酶液活性（取0.5ml测定，在nm处的A值）为纵坐标，作出酶活性曲线图。
（3）以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，梯度洗脱液浓度为纵坐标，绘制出梯度洗脱液浓度曲线图。
（4）分别合并各组分，测定其蛋白质含量和酶活性，并按下列公式计算比活性。
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