本文原载于《中华神经科杂志》年第11期
“脑血管病目前已跃升为国民死亡原因之首，其中卒中是单病种致残率最高的疾病[1]。根据国内外研究，卒中可防可控；高脂血症是动脉粥样硬化性心血管疾病的主要危险因子，60%的冠状动脉粥样硬化性心脏病、40%的缺血性卒中都是由低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)长期升高所致[2]。目前临床上他汀类药物仍是降低LDL-C的主力军，但是即便给予推荐的最大剂量的他汀类药物治疗，仍有60%～70%的患者的LDL-C未达到理想水平[3]。另外，部分患者对高剂量他汀类药物不耐受或因不良反应(如肌痛和横纹肌溶解等)难以足量服用。因此研发可供这部分患者选择的新型降血脂药物对于心血管疾病的防治具有重大意义。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9(proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9，PCSK9)是目前发现的降脂新靶点，因而PCSK9抑制剂为我们提供了一种继他汀药物之后对抗LDL-C的新治疗模式。因此，我们对新降脂靶点PCSK9及目前PCSK9抑制剂的研究现状和进展进行综述。
一、PCSK9的结构
PCSK9是前蛋白转化酶枯草溶菌素家族的第9个成员，人类PCSK9基因定位于染色体1p，长约22kb，含有12个外显子，编码含个氨基酸残基组成的前角蛋白转化酶，由信号肽(SP1～30)、前结构域(31～)、催化结构域(～)和羧基末端结构域(～)顺序连接而成；主要表达于肝脏、肾脏以及小肠[4]。
二、PCSK9在脂代谢中的作用机制
在人类，PCSK9是一种由PCSK9基因编码的酶[5]，可与肝细胞表面的低密度脂蛋白胆固醇受体(LDL-R)相结合。血液中的LDL主要依赖LDL-R清除。当PCSK9与LDL-R结合，受体分解，不再能清除血液中的LDL-C。如果PCSK9被抑制，则会有更多的LDL-R出现在肝脏表面，从而清除血液中更多的LDL-C[6]。因此，阻断PCSK9基因能降低血液中的胆固醇含量[7]。而LDL-R活性在转录过程中受甾醇调节元件结合蛋白2(sterolregulatoryelementbindingprotein2，SREBP-2)的调节，转录后受PCSK9影响[8]。和LDL-R一样，PCSK9在启动区含有一个固醇调节元件(sterolregulatoryelement，SRE)，两者的表达均主要接受SREBPs-2的调节[9]。动物体内的固醇主要以胆固醇(cholesterol)为主，故胞内胆固醇水平降低时，激活胞质中的SREBPs-2并使之发生核转移，与LDL-R及PCSK9的启动子SRE结合，同时激活LDL-R及PCSK9基因转录，LDL-R通过内吞血浆中LDL-C提升胞内胆固醇水平，PCSK9作为一种负反馈机制限制LDL-R的作用。
三、PCSK9的基因突变
人类Pcsk9基因位于1号染色体的短臂上(1p32.3)。年，Abifadel等[10]在研究中首次发现PCSK9基因突变，首次证实PCSK9与血脂代谢之间存在某种关联。根据突变对Pcsk9调节LDL-C水平的影响不同分为两类：功能获得型突变和功能缺失型突变。前者通过与相关蛋白的作用，改变PCSK9的亲和力并增强蛋白水解酶对PCSK9自身裂解的敏感度，增强PCSK9对LDL-R的降解，升高血清LDL-C水平，导致常染色体显性高胆固醇血症(ADH)或早发性动脉粥样硬化疾病，主要形式有SR、DG、FL、RS、DY、NS、RW、HR、EG等[11,12]。而功能缺失型突变可削弱或灭活PCSK9上调LDL-C的能力，导致低胆固醇血症，主要形式有R46L、YX和CX等，这种类型的突变不仅发生率较高，而且同LDL-C低水平相关联(降低28%～40%)[13]。以上发现提示人们，抑制PCSK9功能是一种降低LDL-C水平的有效策略。
四、PCSK9抑制剂分类及研究动态
目前，主流他汀类降脂药物介导LDL-C降低的关键机制为增加LDL-R在肝细胞表面的表达，进而增加LDL-C逆转运，降低血清胆固醇水平。而这一机制部分受到与他汀介导的PCSK9表达和分泌减少相关的负反馈调节的抑制[14]，至少部分减弱了他汀降胆固醇的功效。此外，PCSK9既在胞内作为一个引导LDL-R进入溶酶体的分子伴侣发挥作用，又在循环中促进LDL-R的内化。故而外源性干预措施抑制PCSK9活性后，可加速血清LDL-C的清除，强化降脂[15]。上述发现引起了人们研发PCSK9抑制剂类调脂药物的兴趣。目前已经有多种PCSK9抑制剂进入临床试验，按照抑制机制的不同，目前正在研究的PCSK9抑制剂主要分为以下几类(表1)。
表1目前正在研究的PCSK9抑制剂
(一)单克隆抗体
单克隆抗体是目前研究最多且最快推向临床的PCSK9抑制剂，具有靶向性强、特异度高和毒性、不良反应低等特点。单克隆抗体通过特异性地与PCSK9结合，从而阻断PCSK9与LDL-R的结合，中断LDL-R的内吞和降解作用，很大程度上降低了PCSK9影响肝脏清除LDL-C的能力，使得LDL-C的清除率增加，从而降低LDL-C水平。随着年专利到期，历史上最成功的他汀类药物——辉瑞公司的立普妥(lipitor)将逐渐走下神坛，PCSK9单抗因机制清楚且理论上安全有效而被寄予厚望。目前，evolocumab、alirocumab和bococizumab占据领先地位，而可口服的小分子PCSK9抑制剂正在紧锣密鼓的开发研制中。年6月，FDA支持alirocumab上市，但只支持极高风险人群如家族性高血脂症(14∶2)和高CV风险人群(9∶7)，而反对在他汀不耐受人群使用(7∶9)；同时支持evolocumab上市，其中全票(15∶0)支持用于治疗家族性高血脂症患者。年7月23日，evolocumab作为首个新型降脂药在欧盟批准上市，随后美国也批准赛诺菲/再生元制药的alirocumab上市，这为降脂不理想的患者提供了全新的治疗选择[16]。
1．evolocumab：
evolocumab(AMG-)是Amgeng公司研发的人源单克隆抗体，目前已完成5项Ⅲ期临床研究。
GAUSS-2研究[17]一项为期12周的双盲试验，旨在评估他汀类药物不耐受患者应用PCSK9单克隆抗体的效果，研究者随机将患者以2∶2∶1∶1的比例分为evolocumabmg(2周1次)或evolocumabmg(每月1次)，两组均同时给予相同剂量的安慰剂口服或皮下注射，均给予依折麦布10mg口服。主要终点为患者LDL-C至12周和平均10周、12周的变化。结果显示，共例患者(平均年龄62岁，平均LDL-C1.93g/L)纳入随机化研究。evolocumab对LDL-C水平的降幅为53%～56%，相对依折麦布的治疗差异为37%～39%(P0.)。Evolocumab组患者肌痛发生率低于依折麦布组，其他不良事件发生率两组相似。可得出以下结论：①两种evolocumab方案均能显著降低LDL-C，且效果相同；②evolocumab降低LDL-C、载脂蛋白E和脂蛋白a效果优于依折麦布；③在不能耐受他汀类药物的高危患者中，evolocumab耐受性良好、肌肉症状发生率较低。
MENDEL-2研究[18](Ⅲ期临床试验)评价PCSK9抑制剂单药治疗的效果，以安慰剂和依折麦布为对照。结果显示：治疗12周后，两种evolocumab方案同等程度降低LDL-C(主要终点)，平均比安慰剂组多降低55%～57%，比依折麦布组多降低38%～40%(均P0.)，不同性别、年龄、种族和地区的亚组人群均显著获益。此外，evolocumab显著降低了载脂蛋白E、脂蛋白a和非高密度脂蛋白胆固醇(non-HDL-C)水平(均P0.)，肌肉症状和实验室检查异常的发生率与安慰剂组或依折麦布组相同。
LAPLACE-2研究[19]共在17个国家、个中心纳入例高胆固醇血症或混合血脂异常患者，随机分为24个组。积极治疗组为evolocumabmg每2周1次/mg每月1次。对照组为安慰剂或依折麦布。患者同时接受中等强度的他汀类药物治疗(包括阿托伐他汀10mg、辛伐他汀10mg、瑞舒伐他汀5mg)，或者高强度他汀(阿托伐他汀80mg、瑞舒伐他汀40mg)。结果显示：①他汀治疗基础上，两种evolocumab方案同等程度显著降低LDL-C；②在高强度和中等强度他汀治疗基础上，evolocumab进一步降低LDL-C的百分率相似，LDL-C达标率(0.70g/L)分别为93%～95%和86%～94%；③与安慰剂相比，在他汀基础上加用evolocumab降LDL-C显著优于加用依折麦布(P0.)；④evolocumab的安全性和耐受性与安慰剂或依折麦布差异无统计学意义。该研究证实了evolocumab＋他汀与单用他汀相比可显著降低LDL水平。
FORD-2研究[20]纳入例经他汀类药物治疗而LDL-C仍然≥1.00g/L的杂合子家族性高胆固醇血症(HeFH)患者，随机分4组，治疗12周：①evolocumabmg皮下注射2周1次，②evolocumabmg皮下注射每月1次，③安慰剂皮下注射2周1次，④安慰剂皮下注射每月1次。结果显示，evolocumab每2周注射和每月注射分别使LDL-C降低61%和56%，LDL-C达标率分别较安慰剂组增加66%和61%(均P0.)，还显著降低载脂蛋白E、脂蛋白a和甘油三酯水平(均P0.)，升高了高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平(P0.)。evolocumab耐受性良好，为HeFH患者进一步降低LDL-C提供了新的选择。
DESCARTES研究[21](安慰剂对照的PCSK9抗体长期作用)研究纳入18～75岁、LDL-C≥0.75g/L且甘油三酯4.00g/L的患者，导入期中根据心血管病危险分层和LDL-C水平给予4种不同处理：①单纯饮食控制；②饮食加阿托伐他汀10mg；③饮食加阿托伐他汀80mg；④饮食加阿托伐他汀80mg加依折麦布10mg。4～12周后例LDL-C仍≥0.75g/L的患者随机分组，接受evolocumabmg或安慰剂皮下注射每月1次治疗52周。结果显示，与安慰剂组相比，evolocumab组患者52周时的LDL-C水平较基线值降低57.0%±2.1%，导入期接受不同处理的4组患者LDL-C水平均显著降低(均P0.)。此外，evolocumab显著改善了载脂蛋白E、脂蛋白a、non-HDL-C、甘油三酯和HDL-C水平。evolocumab组总的不良反应发生率与安慰剂组相同，严重不良反应、肌痛和肌酸激酶水平增高发生率略升高，神经认知不良事件发生率略降低，对血糖参数无不利影响，肝酶增高率与安慰剂组相同，研究期间未检出抗evolocumab的中和抗体。
2．alirocumab：
alirocumab(RGEN,SAR236)是Regeneron公司与Sanofi公司联合开发的一种人源单克隆抗体，目前有16项相关的Ⅲ期临床研究，其中大部分已提交注册或已完成。Ⅲ期试验数据显示，不论有或没有同时服用他汀类药物，在多个类别包括家族性高胆固醇血症、动脉粥样硬化性心血管疾病、糖尿病患者和他汀类药物不耐受患者中，alirocumab均显现出了良好的疗效。总的来说，除了轻微而短暂的注射部位反应，alirocumab整体安全性与安慰剂或依泽替米贝相当。目前美国只批准，当家族性高胆固醇血症、动脉粥样硬化性心血管疾病患者服用最大耐受剂量的他汀类药物后还有降LDL的需求时，可以使用75mg和mgalirocumab每2周1次。如果ODYSSEYOUTCOMES试验显示alirocumab具有良好的心血管益处，那其适应证应该将会扩大[22]。
(二)小分子干扰RNA
抑制PCSK9的第2个途径是通过注射由脂质体包裹的小单片段RNA(siRNA)去结合PCSK9的mRNA，使PCSK9mRNA沉默。研究发现小鼠、大鼠和非人类灵长类动物单剂量静脉注射PCSK9siRNA3周后，肝脏PCSK9mRNA水平降低近50%～70%，LDL-C下降60%[23]。另有研究显示，PCSK9siRNA还可以通过减弱人急性单核细胞白血病细胞源性巨噬细胞内核转录因子-κB(NF-κB)的活性抑制oxLDL引起的炎性反应，从而成为治疗动脉粥样硬化的新策略[24]。Alnylam公司的ALN-PCS在Ⅰ期临床试验中使用脂质纳米微粒材料作为传递载体，在32名LDL-C水平大于3.0mmol/L的健康受试者中进行试验。受试者按0.～0.mg/kg6个递增的剂量给予受试药物，结果发现ALN-PCS以剂量依赖的方式降低LDL-C水平，最高剂量组在4d内LDL-C水平下降了40%，血浆PCSK9水平下降了70%[25,26]。其优点为快速，无明显不良反应，但其成本较高，将来是否能作为临床常规用药还有待进一步考究。
(三)反义寡核苷酸(asON)
第3种方法是利用asON通过碱基互补原则结合于PCSK9靶基因mRNA上，从而封闭基因的表达。年对高脂血症小鼠模型以静脉注射PCSK9asON6周后，总胆固醇和LDL-C水平分别降低53%和38%，肝脏PCSK9mRNA表达下调92%。注射PCSK9ASO后所达到的降脂效果类似于PCSK9基因敲除小鼠中所观察到的[27]。而Lindholm等[28]对以猴为模型的研究表明，在给予负荷剂量(20mg/kg)以及4周(每周5mg/kg)维持剂量的SPC5(a14-mer)和SPC(a13-mer)后，这两种PCSK9的反义寡核苷酸均可以使LDL-C水平持续降低。PCSK9mRNA及血清PCSK9蛋白降低了85%，而LDL-C水平则降低了50%，并且在研究期间并未观察到毒物学指标的变化。目前SPC5处于Ⅰ期临床研究阶段。
(四)剪接转化寡聚核酸(SSOs)
SSOs是一种新颖的RNA疗法，主要通过SSOs转变PCSK9mRNA前体剪接形式，从而产生低产量、低活性的剪接变异体[29]。PCSK9剪接异构体(PCSK9sv)最先是由Schmidt等[30]于年提出，他们指出PCSK9sv氨基酸的第58位外显子上存在框内缺失，它在多种组织内均有表达(包括肝、小肠、前列腺、子宫、脑和脂肪组织)；但与野生型PCSK9不同的是，PCSK9sv缺少调节LDLR胞内水平的活性。
(五)CRISPRRNA
随着全基因组测序技术的不断成熟，在各种细菌和古细菌(archaea)中陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences，即CRISPR序列)和CRISPR相关基因(CRISPR-associatedgenes,Casgene)。在CRISPR位点的第1个重复序列的上游定位有CRISPR前导序列(leadersequence),其功能作为启动子；当CRISPR转录后，Cas蛋白加工CRISPRRNA成1个沉默RNA，这个沉默RNA就会对外来同源的DNA起到作用[31]。有研究发现用腺病毒在鼠肝脏表达以pcsk9为靶向的Casgene和CRISPRRNA，可以使血清胆固醇水平降低35%～40%[32]。该抑制方法着眼于基因组编辑，有望成为将来人类心脑血管疾病的新的预防手段。
(六)模拟抗体蛋白药
模拟抗体蛋白药(adnectins)是一种最新的生物治疗方法，由连接不同类型分子的纤维结合蛋白组成，模拟抗体与靶部位相结合的部分。该类PCSK9抑制剂可以通过阻断PCSK9与LDLR的EGF-A结构域的结合从而发挥PCSK9抑制作用。目前在该类抑制剂中处于领先地位的是Adnexus公司与BristolMyersSquibb公司研发的adnectins类PCSK9抑制剂BMS-，该抑制剂正处于Ⅰ期临床试验阶段(北京治疗白癜风哪家医院疗效好哪里治白癜风好
