大家好！这周我分享一篇ncb的文章：Purinyl-cobamideisanativeprostheticgroupofreductivedehalogenases。作者是JunYan等人，最后通讯是UniversityofTennessee的FrankEL?ffler教授,他们组主要从事细菌与环境保护及检测或是药物应用方面的研究。
脱硫肠状菌属（Dsf）是一种严格厌氧的革兰氏阳性菌，存在地表环境，其含有四氯乙烯还原脱卤酶（PCERDases）可对有机卤化物进行还原脱卤，PCERDases发挥功能时需要类咕啉作为辅基，完整的类咕啉结构为上方一个Coβ配体，中间一个含钴的咕啉环，下方为Coα碱基。
本文通过对四氯乙烯培养的脱硫肠状菌属培养基进行氰酸形式类咕啉的提取，以及HPLC分析，发现其主峰与已知类咕啉出峰时间都不符，随后进行紫外-可见光谱分析和质谱鉴定，证实这是一种全新的类咕啉，根据质谱信息可知这是一个轴向上方含有一个α-核唑-5‘-磷酸部分，轴向下发含有一个未知碱基的钴氨酰胺。
为了验证这个类咕啉是否有去甲基或其他的修饰，作者外源加入已知的碱基来定向诱导已知类咕啉的形成，通过HPLC，紫外-可见光谱分析和质谱鉴定，其合成的类咕啉与已知的没有修饰的一致，说明这种内源合成的新的钴氨酰胺理应没有其他修饰，故可推测出碱基部分为无取代的嘌呤。
为了确定新型类咕啉中碱基的结构，作者利用了N15的同位素标记和核磁手段进行分析。N15同位素标记结合质谱分析，发现碱基含有4个N，这与无取代嘌呤相符，随后，作者用1HNMR和COSY对钴氨酰胺进行分析，发现碱基芳环区的质子缺少相互的作用，也与未取代嘌呤相符。
为了进一步进行验证，作者将脱硫肠状菌属的蛋白粗提物进行了bluenativePAGE的分离，然后进行脱氯活性的检测，在片段4发现了最高的活性，随后作者对片段4进行进一步提取和UHPLC–HRMS的分析，发现了类咕啉，且其出峰位置与m/z值与无取代的嘌呤-钴氨酰胺标样一致说明这种全新的类咕啉确实是无取代的嘌呤-钴氨酰胺，其实脱卤酶DsfPceARDases的辅基。
此外，作者还通过进化分析和体外酶活实验，发现了嘌呤被DsfCobT酶活化的特异性；通过在培养基中加入维他命B12或嘌呤-钴氨酰胺，对包括类咕啉缺陷在内的不同菌株进行培养，检测其脱氯效率，发现碱基部分的变化可以调整类咕啉依赖的脱卤酶的活性。
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