ELISA是酶联免疫吸附实验(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称，它是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的技术。今天，小编跟大家聊一下ELISA的实验原理及常见问题分析，希望对大家有用。
一
原理在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应，通过洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与样本中受检物质的量呈正相关，加入底物后，底物被酶催化成有色产物，故可根据吸光值对受检标本的物质进行定性或定量分析。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
二
操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法
1）包被：将抗原或抗体固定在聚苯乙烯上，形成“免疫吸附剂”的过程。其中，蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。用0.05MPH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为10ng/mL～20μg/mL（包被浓度随包被物的不同而不同）。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL，4℃过夜。次日，扣干孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次5min。(简称洗涤，下同)。
2）洗板：4°C包被过夜后，取出ELISA板，甩去板中的液体，加入洗涤液μL//孔，放在摇床摇5min，重复3次，最后用吸水纸尽量拍干板；
3）封闭：洗涤完毕的ELISA，加入封闭液μL/孔封闭ELISA板，放入湿盒内，室温孵育1h；
4）准备：预先准备和稀释好标准品和样品；
5）洗板：取出ELISA板，甩去板中的封闭液体，加入洗涤液μL//孔，放在摇床摇5min，重复3次，最后用吸水纸尽量拍干板；
6）加样：加入预先准备和稀释好的标准品和样品（未知抗原）μL//孔，放入湿盒，室温孵育2h；
7）洗板：取出ELISA板，甩去板中的液体，加入洗涤液μL//孔，放在摇床摇5min，重复3次，最后用吸水纸尽量拍干板；
8）加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第一抗体(经滴定后的稀释度)，μL//孔，放入湿盒，室温孵育1h；
9）洗板：取出ELISA板，甩去板中的液体，加入洗涤液μL//孔，放在摇床摇一分钟5min，重复3次，最后用吸水纸尽量拍干板；
10）加入底物：加入预先准备和稀释好的底物，μL//孔，放入湿盒，室温避光孵育30min左右，连续观察颜色变化；
11）加终止液：颜色变化不在明显变化时，加入终止液中止反应；
12）检测：根据酶标仪器操作方法，上机检测OD值，通过计算获得所测物质的浓度。
方法二用于检测未知抗体的间接法
1）包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至10ng/mL～20μg/mL，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL，4℃过夜。次日，扣干孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次5min。(简称洗涤，下同)。
2）加样：加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1mL于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1h，洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)。
3）加酶标抗体：加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗未知抗体的抗体)0.1mL，37℃孵育0.5～1h，洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
三
ELISA免疫反应中常用的酶和底物四
ELISA实验中的注意事项与常见问题（1）注意事项
①自配的缓冲液应用PH计测量校正。
②从冰箱取出的试剂应待温度与室温平衡后使用。
③加样时注意不要溅出，不要产生气泡。
④在ELISA实验中，洗涤很重要。
⑤比色时，擦干底板附着的液体。
⑥酶标仪使用前，提前预热机器。
（2）常见问题及解决方法
①高背景或阴性对照值偏高
②阳性对照值偏低或低吸光度
③标准品标准曲线良好，样本无检测信号
④重复性较差
⑤OD值整体偏低
ELISA实验操作简单，敏感性高，用到的主要设备是酶标比色仪，可同时检测大量标本，是目前最常用的检测细胞因子蛋白表达量的方法。
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