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随着CRISPR/Cas基因编辑系统的诞生，其在植物领域得到广泛的应用和开发新的用途，日新月异，发展迅速。因此，我们经《华南农业大学学报》授权转载了最新综述文章：刘耀光,李构思,张雅玲,等.CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展[J].华南农业大学学报,,40(5):1-12.以便让大家细细品读，快速了解该领域发展现状！
摘要:基因编辑技术的发展与应用为植物功能基因研究和作物遗传改良提供了重要的技术支撑。近年诞生的CRISPR/Cas基因编辑系统(主要包括CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a)与其他的基因编辑技术相比，具有操作简单、效率高等优势，因此在动植物中均得到广泛应用。本文结合CRISPR/Cas基因编辑技术体系的发展历史及最新研究进展，着重介绍了该技术在植物领域中的应用范围和发展方向，以及基因编辑植物的靶点分析方法；对目前CRISPR/Cas基因编辑技术体系存在的问题进行了分析并提出了改进策略。
基因功能的鉴定和作物新品种的选育离不开突变体的获得，之前突变体的获得主要依靠自然突变、物理或化学诱变以及T-DNA随机插入等手段[1]。这些方法存在突变效率低、突变位点随机等缺陷，且后续还需要通过图位克隆等耗时耗力的技术手段才能最终确定突变基因。因此，在特定的位点引入核苷酸变异，实现基因的定点编辑能高效地获得目标突变体，从而加快基础研究和遗传育种的进程。基因编辑技术主要是利用序列特异性核酸酶(Sequencespecificnucleases,SSNs)在特定基因位点产生DNA双链断裂，借助编辑受体自身的DNA修复系统在非同源末端连接(Non-homologousendjoining,NHEJ)过程中产生随机的Indels(Smallinsertionsanddeletions)或在同源重组修复过程中插入或替换相应的基因片段，最终实现基因组序列的突变。现有的基因编辑系统主要包括锌指核酸酶(Zincfingernucleases,ZFNs)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs)系统以及CRISPR/Cas(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat-associatedprotein)系统[2]，其中，CRISPR/Cas系统由于载体构建过程简单、编辑效率高等优点，成为当前广泛应用的主流基因编辑系统。本文回顾了CRISPR/Cas系统的发现和编辑技术体系建立的历程，介绍了CRISPR/Cas编辑技术在植物中的应用以及编辑结果的分析方法，并展望了CRISPR/Cas基因编辑技术以及编辑靶点分析技术的发展趋势。
1CRISPR/Cas免疫系统的作用机制和分类
科学家们对CRISPR/Cas免疫系统的研究早在30年前就已经开始。年，日本研究团队在研究大肠埃希菌Escherichiacoli碱性磷酸酶的同工酶基因iap的时候发现，在该基因的3＇端存在特殊的侧翼结构，即29bp的高度相似序列分别被32bp序列间隔，形成了5个拷贝的串联重复序列[3]。但该团队并未对此现象进行更深入的研究。Mojica等[4-5]对此产生了浓厚的兴趣，他们利用生物信息学检索探究，在20多种微生物中都发现了类似的短序列重复结构，并将这种短序列重复结构命名为规则的短间隔重复(Shortregularlyspacedrepeats，SRSRs)；提出SRSRs可能存在于原核生物基因组，包括所有嗜热细菌和古细菌中以及部分的蓝藻和变形菌门生物；总结了SRSRs的基本特征：24~40bp的短回文序列(回文区可达11bp)成簇存在，并被非重复的20~58bp序列间隔开来。年，为了更贴切地表示SRSRs的特征以及避免命名的混乱，Jansen与Mojica商定将SRSRs更名为成簇有规律的间隔短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)。Jansen等[6]发现大部分种类的原核生物具有2个或2个以上的CRISPR基因座前导序列，而这些CRISPR基因座前端共享一个~bp的种间保守前导序列，并通过比较CRISPR基因座侧翼的基因组信息，鉴定出不同原核生物中高度相似的4个CRISPR关联基因：Cas1~Cas4。年，Mojica等[7]再次发表了对CRISPR/Cas系统研究的最新结果，他发现CRISPR中的间隔序列大部分来自噬菌体或接合质粒，并且携带某一噬菌体片段的细菌具有对相应噬菌体的抵抗力；CRISPR基因座存储了病原菌的基因信息，可能是微生物适应性免疫系统的一部分。随后，另有2个科研团队也发表了相近结果的论文[8-9]。年，Barrangou等[10]证明了在噬菌体攻击后，筛选到的抗性细菌的CRISPR区整合了新的间隔序列，而间隔序列正是来源于噬菌体DNA，也就是说，细菌通过识别与噬菌体序列相同的CRISPR间隔区对应的特定序列，获得对噬菌体的抗性，产生适应性免疫能力；还确认了CRISPR关联基因Cas7帮助细菌获得新的间隔序列和重复，Cas9则发挥了核酸切割酶的作用，为细菌免疫系统所必需。随后的几年，CRISPR细菌免疫系统的必要条件和作用机制相继被发现和证实，如CRISPR中依靠重复序列形成的crRNA是CRISPR产生抵抗力的关键[11]，Cas9切割的对象是DNA[12]，且对DNA的精准切割的位点与crRNA特定序列和PAM(Proto-spaceradjacentmotif)序列有关[13-14]，Ⅱ型系统中tracrRNA也参与了Cas9的切割[15]等等。
CRISPR/Cas系统广泛分布于90%的古细菌及50%的细菌基因组或质粒上[16]。它由CRISPR基因座和Cas基因2部分组成，其中，CRISPR基因座又包括位于CRISPR基因座上游富含AT碱基的前导序列(Leader)、涵盖回文序列的20~50bp的重复序列(Repeat)和从外源捕获的间隔序列(Spacer)。CRISPR/Cas系统的免疫过程分为3个阶段[17]：1)外源DNA首次入侵时，细菌进入适应阶段，来源于噬菌体或质粒上的前间隔序列(Protospacer)的DNA同源短片段被整合到CRISPR基因座前导序列下游中，形成新的间隔序列；2)外源DNA再次入侵时，细菌激活了表达阶段，CRISPR基因座转录出前体crRNA，由内切核糖核酸酶催化加工成成熟的crRNA；3)在干扰阶段，成熟的crRNA引导Cas蛋白复合物靶向噬菌体前间隔序列位置，识别噬菌体基因组内的PAM序列，对外源靶标位置精准切割从而避免细菌切割自身CRISPR基因座。
年，Jinek等[15]在《Science》上发表研究成果，证明了crRNAs(CRISPRRNAs)与反式作用crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)配对结合后形成双分子的RNA结构，可以介导Cas9蛋白定向切割DNA序列。年，张峰团队率先利用CRISPR/Cas9技术在人类和小鼠细胞内实现了精准的基因编辑，并构建了可同时靶向多个位点的基因编辑系统[18]。此后，CRISPR/Cas基因编辑技术蓬勃发展。
Makarov等[17,19]根据Cas基因的数目和功能将CRISPR/Cas系统分为了2大类5种类型(Ⅰ~Ⅴ)16种亚型，其中，Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型属于第1类，它们在干扰靶基因时需要多个Cas蛋白形成复合物协同工作；Ⅱ和Ⅴ型属于第2类，它们利用单一Cas蛋白就能够干扰靶基因。第2类Ⅱ型系统较为简单，研究也更加透彻，目前应用较广的CRISPR/Cas9系统为Ⅱ型CRISPR系统，而新兴的CRISPR/Cas12a(Cpf1)系统属于Ⅴ型CRISPR系统。Shmakov等[20]年又发现了Ⅵ和Ⅴ型的2种亚型。
2CRISPR基因编辑系统的建立
在对细菌的CRISPR/Cas免疫系统及作用机理有了较深的认识后，科学家们开始对该系统进行改造并应用于动植物的基因组编辑。目前应用最广泛的CRISPR基因编辑系统主要包括CRISPR/Cas9系统和CRISPR/Cas12a系统。
2.1CRISPR/Cas9系统的建立
CRISPR/Cas9是目前报道的唯一被优先应用于基因编辑的Ⅱ型系统。与Ⅰ和Ⅲ型CRISPR系统需要多个Cas蛋白形成复合物共同发挥功能的机制不同，Ⅱ型CRISPR系统仅需1个Cas蛋白和2个RNA元件即可实现对靶DNA的切割[15]。为了进一步简化CRISPR/Cas9系统，研究者通过保留必需元件tracrRNA和crRNA的核心序列并引入连接区，将两者合并为一个sgRNA(SingleguideRNA)，并通过体外试验证实Cas9蛋白能在sgRNA的引导下切割双链DNA，这一系列成果为CRISPR/Cas9在基因编辑中的广泛应用奠定了坚实基础。自年起，利用CRISPR/Cas9技术相继实现了对人类细胞、小鼠细胞、斑马鱼、果蝇、水稻、拟南芥等真核系统中的内源基因组编辑[21-30]。
CRISPR/Cas9基因编辑技术主要包括两大核心内容：1)构建Cas9/sgRNA表达载体，将载体导入受体细胞表达发挥编辑作用；2)将表达纯化的Cas9蛋白与合成的sgRNA导入受体细胞发挥编辑作用。来源于链球菌Streptococcuspyogenes的Cas9蛋白SpCas9最先被应用于基因编辑，该蛋白含有一个RuvC-like结构域和一个HNH核酸酶结构域，两者分别在靶DNA的PAM序列“NGG”上游3nt处对DNA双链进行切割，形成平末端。在真核系统中，需要在Cas9蛋白中添加一段核定位信号以保证该蛋白进入细胞核正常发挥功能。sgRNA是一段具有特定结构的单链RNA，其5＇端约20个碱基与靶DNA互补配对结合，引导Cas9/sgRNA复合物对相应位点进行切割，决定编辑位点特异性。因此，在构建Cas9/sgRNA表达载体编辑受体基因组中不同的位点时，只须改变sgRNA中5＇端的特异位点识别序列，而其他元件可保持不变，极大地降低了载体构建的技术门槛。此外，通过构建多个sgRNA表达盒的串联载体，可实现同时对多个靶位点的有效编辑，显著地提高了该系统的编辑效率。在Cas9/sgRNA表达载体构建完成后，需要通过多种转化手段将表达元件或Cas9/sgRNA产物导入到编辑受体中发挥功能。在植物系统中，将Cas9/sgRNA表达载体导入植物细胞的有效方法包括原生质体PEG转染、农杆菌叶片注射法、基因枪轰击、农杆菌介导转化等，不同方法在不同植物中的编辑效率各异[31-33]。在此基础上，不同实验室针对植物系统影响编辑效率的关键因素如sgRNA序列、启动子选择、Cas9变体或同源蛋白的选择等进行了一系列探索和优化[31,33-35]。
2.2CRISPR/Cas12a系统的建立
虽然CRISPR/Cas9被广泛应用，但该系统仍存在编辑位点受限、脱靶情况较多等缺陷，因此开发与建立新的CRISPR基因编辑系统是科学家们研究的热点之一。CRISPR/Cas12a属于Ⅴ型CRISPR/Cas系统，它同样只需一个Cas蛋白即可对双链DNA进行切割，但其作用元件和作用模式与CRISPR/Cas9截然不同[36]。首先，仅携带RuvC-like结构域的Cas12a在crRNA引导下即可切割双链DNA，不需要tracrRNA的参与；其次，C12a特异识别富含T的PAM序列；最后，Cas12a在靶DNA的PAM序列下游18nt处(正链)和23nt处(负链)对DNA双链进行切割，形成黏性末端。与CRISPR/Cas9相比，该系统具有如下独特优势[37-38]：1)CRISPR/Cas12a系统的crRNA比sgRNA更短，且Cas12a蛋白也比Cas9蛋白更小，因此，CRISPR/Cas12a适用于更多装载量小的载体系统，特别是多靶点编辑的情况；2)Cas12a切割DNA后形成黏性末端，增加了HDR修复途径发生的概率，有利于DNA片段的定点插入和替换；3)在多个物种的基因编辑中，CRISPR/Cas12a表现出更低的脱靶率。
目前，CRISPR/Cas12a在基因编辑中的应用仍局限于少数物种，植物的研究大部分集中在水稻系统[39-46]以及少数烟草、拟南芥、大豆和玉米等系统的报道[39,42,46-47]。这可能是因为CRISPR/Cas12a在低温条件下编辑效率低[46]，且较严格的PAM序列“TTTV”降低了该系统的编辑范围。基于其自身的优点及局限性，CRISPR/Cas12a成为了继CRISPR/Cas9后第2个被广泛白癜风品牌影响力单位北京白癜风治疗哪家好
