葡萄糖比色法/荧光法检测试剂盒Protocol及操作要点
（BioVision,K-）
实验背景
葡萄糖是能量分子ATP的主要来源，是许多新陈代谢类疾病研究和药物开发过程中的关键诊断参数。
实验原理
葡萄糖酶混合物特异性氧化葡萄糖，生成有色（ODnm）和荧光（Ex/Em=/nm）的产物，产生的颜色或荧光强度与葡萄糖含量成正比。
检测范围
1-00μM
样本制备
样本可以是：哺乳动物的血清、血浆、其他体液，食品，培养基等
血清：正常血清中含有约5nmol/μl的葡萄糖，因此每孔添加血清量为0.5-2μl，最终体积调整为50μl。
组织：称量20-50mg组织，加入-μl预冷的AssayBuffer。使用杜恩斯匀浆器（BioVisionCat#-1）或在冰上轻度超声处理，完全匀浆后，以4℃，10,g离心5min，取上清液并将其用于测定。
细胞培养上清：离心去除细胞碎片，使用上清液进行测定，但细胞培养基中的蛋白质可能不像其他样品类型（例如血清，血浆等）那样多。
注意：
1.内源酶活性可能导致葡萄糖损失，所有含有酶活性的样品都建议使用10kDa旋转柱（BioVisionCat＃）对上清液进行脱蛋白处理。
2.对于未知葡萄糖浓度的样本，建议用AssayBuffer稀释多个倍数尝试，以确保读数在标准曲线范围内。
3.为了减少内源性化合物的干扰反应，确保准确测定样品中的葡萄糖，建议使用已知量的标准品（4nmol）加标样品。
4.若样本自身有背景，需要做样本孔对应的背景孔。
标曲制备
比色法检测：用AssayBuffer将葡萄糖标准品稀释倍至1nmol/μl，在96孔板依次加入0、2、4、6、8、10μl，AssayBuffer补足50μl/孔，得到每孔葡萄糖标品分别为0、2、4、6、8、10nmol。
荧光法检测：用AssayBuffer将葡萄糖标准品稀释0倍至0.1nmol/μl，在96孔板依次加入0、2、4、6、8、10μl，AssayBuffer补足50μl/孔，得到每孔葡萄糖标品分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0nmol。
葡萄糖反应混合液
对于每个孔，准备总量为50μl的反应混合物，其中包含：
标准品孔：50μl标品+50μl反应混合液
样本孔：50μl样本+50μl反应混合液
样本背景孔：50μl样本+50μl背景对照混合液
注意：荧光检测法比比色检测法灵敏度高约10倍，每个反应孔使用0.4μl探针可显着降低背景/提高检测灵敏度（用AssayBuffer补足）。
标曲（a）比色法；（b）荧光法
为什么标准曲线值常常低于说明书上显示的值？
有多种因素会影响信号，如孵育时间，室温，处理等，一般要增加标准品的值，可以增加孵育时间。但只要标准曲线是线性的，就可以使用，因为所有样品都将在相同条件下检测。
检测
反应体系37°C，避光温育30min，酶标仪吸光度（ODnm）检测或荧光（Ex/Em=/nm）检测。
附上操作视频
比色法
荧光法
计算
标准品读数减去葡萄糖浓度为0空白的空白孔的读数，制作标曲；样本读数减去标曲中葡萄糖浓度为0空白的空白孔和样本背景孔（如果有）的读数。
未加标样品：
样品葡萄糖浓度（C）=B/VXDnmol/μl或mM
B是样品孔中的葡萄糖量（nmol）；V是加到反应孔中的样品量（μl）；D是样品稀释倍数
加标样品:
样本孔中葡萄糖的量（B）=
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