一．背景介绍
肝细胞癌（HCC）在世界癌症死亡原因中排名第四，乙型肝炎病毒（HBV）是主要的致病因素，在发展中国家其发病率还在逐年增加。目前未有指标可明确诊断早期症状，从而致使HCC的不良预后。因而需确定准确的标志物，以提高诊断HCC水平和预后判断水平。
转录组学的微阵列技术能更准确地检查肿瘤的转录谱。将生信分析应用于微阵列表达模式有助于优化可能的精确标记。UBA1（一种泛素激活酶的E1酶）的异常表达与肺癌（LC）和皮肤鳞状细胞癌（SCC）有关，揭示了UBA1作为HCC诊断的潜在价值和预后指标。
铁死亡是一种铁依赖的细胞死亡类型，在促进脂质过氧化的同时积累三价铁。诱导铁死亡有助于选择性地消除几个癌细胞，解释了治疗癌症的一种新策略。尽管在某些肿瘤细胞中发现了一些铁死亡调控因子，但其调控机制仍不清楚。
因此，作者结合生信分析与体外分析，研究UBA1能否作为HCC诊断和预后预测的可能标志物以及调控HCC细胞的机制。
二．流程分析
三．结果解读
鉴定差异表达基因（DEG）
?用limmaR包分析GSE和GSE的DEG表达模式。（表1）
?GSE中个DEGs上调，个DEGs上调；GSE中个DEG被上调，个DEG被下调。（图1A，B）
?经过PCA，GSE获得的DEG有助于全面区分HCC和非癌样品，而在GSE中也得到了类似的发现。（图1C，D）
表1.获取的肝癌微阵列表达谱
图1.基于GSE和GSE数据集的HCC样本中的DEG分布
2.WGCNA确定HCC早期相关模块
?WGCNA算法识别两GSE中筛选出的个DEG共表达模块并建立软阈值，确定软阈值功效的影响。（图2A，B）
?对个DEG层次聚类分析，通过动态期切树算法确定了三个共表达模块。（图2C）
?根据GSE的临床特征与共表达模块的相关性，确定与特定临床特征相关的HBeAg和HBsAg的表面抗原。（图2D）
?过滤个MEturquoise模块基因，构建具有98个节点和个边的基因-基因相互作用网络。（图2E）
图2.加权基因共表达网络分析
3.MEturquoise模块的富集分析
?R包clusterProfiler对个DEG进行功能注释，主要包含生物过程、细胞成分和分子功能三个类别。还列出了前10个显著富集的KEGG。（图3A—D）
?针对不同的信号转导途径进行网络分析，得到关键基因。（图3E，F）
图3.MEturquoise模块中的DEG功能丰富
4.HCC预测的诊断签名与预后签名
?LASSO回归分析构建诊断特征，从TCGAHCC中筛选的个基因的表达谱应用于诊断模型，获得11个候选基因。（图4A，B）
?分析TCGA正常对照和HCC诊断特征的评估分数，肝癌患者评估分数显著上调。TCGAHCC队列显示11个候选基因的表达模式。（图4C，D）
?通过LASSO回归算法和多变量Cox比例风险回归分析筛选个MEturquoise模块基因，获得13个风险基因。（图5A）
?基于13个风险基因建立预后特征并分析每个样品的风险评分用来分组，还显示了训练患者的生存状态分布。热图可验证风险评分的准确性。（图5A，B）
?验证队列与训练队列结果类似，且在KM生存曲线上都表明高风险组相较低风险组预后较差。两者绘制的ROC曲线说明该结果可信度高。（图5C—G）
图4.构建的诊断模型
图5.构建的预后模型
5.潜在的新颖标记
?分析特征基因的临床意义，初步筛选发现UBA1具有显著的临床价值。UBA1在三个数据集中的HCC样品高表达。（图6A—C）
?在TCGA-LIHC中UBA1表达的增加与存活率低显著相关。UBA1的差异表达与肿瘤等级显著相关。（图6D，E）
?通过IHC分析，得知在肝癌中UBA1蛋白表达水平明显高于相应的非肿瘤组织。（图6F）
?UBA1的上调可能是肝癌诊断和预后预测的期望标志。
?提取THLE-2，HepG2和Huh7细胞的总RNA和蛋白质进行qRT-PCR和蛋白质印迹分析。
?HepG2和Huh7细胞中UBA1的表达水平升高，且Huh7细胞中UBA1水平明显高于HepG2细胞。（图7A，B）
图6.UBA1的临床意义
图7.验证HCC细胞中UBA1的水平
6.UBA1沉默抑制肝癌细胞的恶性表型和铁死亡
?慢病毒介导的UBA1shRNA（shRNA＃1和＃2）转染Huh7细胞，其UBA1mRNA表达明显下调，则成功敲除UBA1。（图7C，D）
?相比NC-siRNA组，UBA1-shRNA组显示出明显降低的Huh7细胞增殖；UBA1敲低细胞显示出降低的迁移或侵袭能力。则UBA1是Huh7细胞迁移和入侵所必需的。（图7E；图8A—C）
?UBA1敲低上调了细胞中二价铁的含量，而且UBA1抑制促进了Huh7细胞内MDA的积累。则UBA1可以作为调节Huh7细胞内MDA和二价铁含量的铁死亡调节剂。（图8D，E）
图8.改变的UBA1表达对HCC细胞恶性表型和铁死亡的影响
7.UBA1沉默抑制Nrf2信号传导途径
?进行相关性分析，UBA1水平与Nrf2呈正相关。UBA1基因敲除显著下调了Nrf2水平，以及下游基因(HO-1、NQO1和FTH1)的表达。这说明UBA1是参与OS反应通路的关键基因。（图9A—C）
?Oltipraz处理不同水平的细胞，确定Nrf2通路激活与Huh7细胞中UBA1敲低抑制的改变之间的关系。（图9D，E）
?奥替吡联合治疗可完全逆转UBA1敲低对细胞增殖，侵袭，转移和铁死亡的抑制作用。（图8A—G）
?UBA1通过Nrf2途径调节HCC细胞铁死亡和生物学行为。
图9.Nrf2的信号转导通路
四．总结
在本次研究中，作者基于两个不同的HCC数据集分析了个DEG，发现UBA1可通过Nrf2途径调节HCC细胞的铁死亡。然后作者根据诊断和预后模型的特征基因，证明UBA1的沉默抑制活癌细胞中的增殖，迁移，侵袭并增加二价铁和MDA水平。因而说明UBA1可作为肝癌进展的独立指标。这项工作为揭示HCC发展的新机制提供了重要途径。
但由于这项研究是在体外进行的，只能推测抑制Nrf2调节因子UBA1可能作为HCC的候选治疗策略。但这种治疗方法还需要在体内验证，并进一步发展用于治疗HCC。
Thankyou！
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