巨噬细胞来源的细胞外囊泡包含甘氨酰tRNA合成酶1，具有抗癌能力
巨噬细胞、细胞外囊泡、棕榈酰化、肿瘤微环境、甘氨酰tRNA合成酶1（GARS1）巨噬细胞分泌的甘氨酰tRNA合成酶1（GARS1）可促进癌细胞凋亡，但是目前GARS1的分泌机制尚不清楚。本文研究发现GARS1通过细胞外囊泡（EVs）分泌，并且在C位点发生棕榈酰化后锚定在膜上，而分泌GARS1的EVs富含其他抗癌活性的因子（IGF2R、vimentin）。本文揭示了GARS1的独特分泌机制，也阐述了肿瘤发生过程中介导免疫反应的细胞内因子。各种胞内蛋白在细胞外介导生物学过程，也有一些蛋白缺乏经典的分泌蛋白信号肽，这些蛋白是非传统分泌方式分泌，例如HMGB1通过囊泡或分泌型溶酶体分泌，表明蛋白有多种分泌途径。ARSs家族蛋白在蛋白合成中起重要作用，其分泌有多种方式，在细胞外功能也是多样的。ARSs在细胞内外显示出不同的功能，而ARSs免疫相关活性与分泌型蛋白类似。先前报道中，巨噬细胞在应激状态下可分泌GARS1促进癌细胞死亡，因此本文着重研究GARS1的分泌方式及其作用机制。巨噬细胞在应激下（无血清/无糖）与癌细胞共培养后可促进GARS1的分泌，用蛋白质运输各个步骤的抑制剂探究GARS1的分泌机制，分别阻断内质网和高尔基体介导的蛋白质分米米、膜起泡、ABC转运蛋白、线粒体呼吸链。结果显示GARS1的分泌未受影响。胆固醇合成抑制剂处理后GARS1分泌被抑制，而胆固醇是EVs合成所必须的，高速离心后仍可检测到GARS1，提示GARS1的分泌与EVs相关。将巨噬细胞与癌细胞/非癌细胞共培养，提示肿瘤细胞可诱导GARS1-EVs分泌。与经典外泌体marker相比，GARS1-EVs分泌情况不同，提示其独特的分泌方式。对外泌体进行表征，而后DiI标记观察饥饿状态下GARS1-EVs的分泌量，DAPI观察蛋白的位置是否在核内。结果显示：GARS1由巨噬细胞分泌并且锚定在EVs的膜上。GARS1易被胰蛋白酶消化，表明在膜上。不可渗透的生物素标记EVs，去污剂释放生物素化的蛋白质，沉淀，用抗GARS1抗体对沉淀蛋白进行免疫印迹，从缺糖培养中分离的EVs中GARS1更高。分析结构表明GARS1无跨膜结构域，但是存在棕榈酰化位点（调节蛋白质膜运输的修饰），不同物种棕榈酰化位点保守，提示该功能重要。分别用抑制剂抑制棕榈酰化或突变棕榈酰化位点验证棕榈酰化在GARS1中的重要性。细胞外裸GARS1可结合于EVs，免疫荧光共聚焦检测结合部位。结果显示：GARS1可结合在EVs膜上，并且脂质修饰对于GARS1的摄取也非常重要。对包含GARS1的EVs提取其中蛋白质进行液相色相质谱分析（LC/MS-MS），利用Cytoscape对蛋白功能进行连接映射，结果显示：氨基酰基tRNA合成酶与GARS1相关。探究GARS1-EVs对癌细胞的作用，纯化的GARS1可促进癌细胞死亡，因此对GARS1-EVs功能也聚焦于促凋亡途径。电镜下检测癌细胞H对GARS1-EVs的摄取，并且冷冻电镜验证摄取的GARS1-EVs中包含GARS1。将GARS1-EVs与裸GARS1对比生长抑制作用的差异，免疫荧光检测凋亡细胞与GARS1-EVs的相关性，在有/无GARS1抗体存在下综合对比GARS1-EVs与裸GARS1的生长抑制作用。下游关于凋亡过程的差异蛋白有IGF2R和vimentin，分别抑制巨噬细胞IGF2R和vimentin所提取的GARS1-EVs验证IGF2R和vimentin在其中的作用。结果显示：GARS1-EVs具有抑制癌症生长的作用，这一作用与IGF2R和vimentin有关。往期·推荐
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