DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的ππ共-轭作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基，DPPH可以捕获（“清除”）其他的自由基。因此通过加入DPPH后观察某一化学反应的速率是否减慢，来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。
由于DPPH自由基在以~之间为中心处具有强烈的吸收，因此在溶液中呈现深紫色，并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。上海惠诚生物利用这一特性可以直观地检测反应的过程，通过记录DPPH吸光度值或者EPR信号的变化可以得到初始自由基的量。
一.测定原理
DPPH自由基是一种较稳定的含氮自由基，有一个单电子，在nm下有强吸收，如果有其他物质提供一个电子使此单电子配对，其吸收会消失褪色，褪色程度与接受电子的量呈正比。即反应物清除氮自由基的能力与试剂在nm的吸光值成反比。
二.试剂组成
试剂一：DPPH试剂μL支
试剂二：μg/mL维生素C标准溶液1ml×1支
三.储存条件及有效期
试剂盒-20℃可保存6个月。
四.自备实验用品
可见分光光度计、恒温水浴锅、1mL玻璃比色皿、台式离心机、无水乙醇、研钵/粉碎机、烘干箱、30~50目筛和蒸馏水。
五.试剂的配置
试剂一：
37℃平衡20min以上，待试剂融化后，在试剂瓶中加入10ml95%乙醇或无水乙醇，剧烈震荡使试剂充分溶解。
注意：溶解一定要充分，如有条件可采用超声波助溶。
试剂二应用液：
根据是否需要制作阳性对照标准曲线有两种配制方法。
1.如仅需要将维生素C作为质控品，可取μL试剂二，加入μL样品稀释液，充分混匀，配制成10μg/mL维生素C；
2.如需测定维生素C的IC50，可分别移取0，2，5，10，15，20，25，30，40，50μL试剂二于空离心管中，再依次加入，98，95，90，85，80，75，70，60，50μL样品稀释液，充分混匀。配制成0，2，5，10，15，25，30，40，50μg/mL维生素C样品。
六.操作步骤
1空白管很重要，建议做3个以上平行；
2如样品颜色较浅可不做对照管
具体步骤：
1、在空白孔1、测定孔和质控孔中分别加入uL试剂一；
2、在测定孔和对照孔2中分别加入uL样品溶液；
3、在质控孔中加入uL提前准备好的试剂二应用液；
4、在空白孔中加入uL样品稀释液；
5、充分混匀，室温避光静置30min使之充分反应。nm处采用酶标仪测定吸光值。
六.计算公式
注：1如未做对照孔，可以将其视作为0；
2质控孔求值时将其视作测定孔进行计算即可。
七.注意事项
1.如样品中色素物质不是分析对象，建议先通过SEPC18柱进行脱色处理，处理后样品可不做对照孔；
2.如不确定样品的氮自由基清除能力，可先做不同浓度的稀释液进行摸索，并选择适宜浓度进行测定，
高浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。
3.混匀很重要，建议加样时反复吹打，加样结束后剧烈振摇酶标板1分钟以上（液体不能溅出来）
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