全面认识环化ADP核糖异构体

望夜环化ADP核糖（cADPR）异构体是一类信号分子，由细菌和植物的Toll/白介素-1受体（TIR）结构域通过NAD+水解产生。TIR结构域约含个氨基酸，广泛分布于动物、植物和细菌中，可与同种或其他TIR结构域结合而行使功能。在植物和动物中，该结构域主要存在于免疫相关蛋白（如Toll-样受体（TLR）、IL-1受体及配体、富含亮氨酸重复受体）中。TIR结构域可形成高度规则的寡聚体，并利用合作组装系统（SCAF）进行信号放大。细菌中含TIR的蛋白主要是一些毒力因子，也存在于对抗噬菌体的防御系统中。许多TIR结构域都具备切割烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的能力，如动物中的SARM1，其TIR结构域执行程序性轴突死亡，可将NAD+切割为烟酰胺和ADPR或环化ADPR（cADPR）。类似地，植物NLR的TIR结构域也可将NAD+切割为烟酰胺和ADPR或v-cADPR（一种cADPR异构体）。两者水解NAD+都需要一个保守的催化性谷氨酸。细菌的TIR结构域也将NAD+切割为烟酰胺和ADPR或v2-cADPR（另一种cADPR异构体）。TIR结构域的自结合（self-association）是其NADase活性必需的。动物SARM1的结构及植物TLR的结构此前都已获得揭示，但细菌TIR结构域的结构和功能报道得很少。近日，澳大利亚昆士兰大学BostjanKobe与格林菲斯大学的ThomasVe联合领导的研究团队在Science发表研究长文CyclicADPriboseisomers:Production,chemicalstructures,andimmunesignaling，系统介绍cADPR异构体的环化位点、由TIR结构域催化产生的分子机制、及其在细菌和植物免疫通路中的功能。作者首先表达并纯化出鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii）AbTir蛋白和AquimarinaamphilectiAaTir蛋白的TIR结构域，两者可分别产生v-cADPR和v2-cADPR。实时核磁（NMR）和荧光分析证实两种蛋白均可催化产生cADPR异构体，且AbTirTIR催化产生的v-cADPR与植物免疫受体L6和ROQ1催化产生的cADPR异构体是一致的。作者随后使用HPLC纯化出v-cADPR和v2-cADPR，并使用NMR解析出两者化学结构。NMR数据显示，AbTirTIR催化ADPR形成(1’’→2’)O-糖苷键，而AaTirTIR催化ADPR形成(1’’→3’)O-糖苷键。作者认为两种环化的ADPR很可能依然保留NAD+中的β-构象。图1四种ADPR的分子结构由于SARM1和植物TIR结构域发挥NADase活性都需要自结合，因此作者使用偶联多角度光散射的分子筛层析（SEC-MALS）检测并确认AbTir存在浓度依赖的自结合，还发现有效的NAD+切割需要TIR蛋白发生构象重组。因此，产生cADPR的细菌TIR结构域同样需要自结合以发挥NADase活性。为确认其分子细节，作者解析出AbTirTIR及另一种可产生v-cADPR的多形类杆菌（Bacteroidesthetaiotaomicron）BtTirTIR的晶体结构，发现AbTirTIR的结构非常类似已解析的几种细菌TIR结构，但两个新结构与之前报道可形成c-ADPR的TIR蛋白结构相似性较差。文献报道保守的谷氨酸残基位于βA折叠片、AA和BBloop、αB和αC螺旋共同形成的口袋中，但在本文解析的两个结构中αB和αC螺旋构象不同，导致对应的谷氨酸残基暴露于表面，且其周围的区域结构高度可变，表明两种TIR蛋白处于非活性构象。那么AbTir的活性状态是什么样？作者使用冷冻电镜解析出NAD+水解的碱基交换产物（8-氨基喹啉，3AD）与AbTirTIR的复合物结构，因为NAD+在此状态下更稳定，高浓度时可抵抗酶的切割。结构显示3AD分子位于AbTirTIR单体之间，自组合体中TIR结构域的组织形式与此前报道的不同，反而类似TLR接头蛋白MAL和MyD88的聚合形式，呈头尾相接方式。组合过程伴随着BBloop、αB和αC螺旋的构象调整，前两者倾斜约50-55°，而αC螺旋重新折叠，并包含此前CC和CDloop的残基。这种重构导致AbTirTIR活性位点及3AD分子的构象十分类似SARM1TIR。作者还使用点突变验证活性位点区和单体界面上的关键氨基酸，分析突变体NADase反应的产物，发现仅WA突变体产生的v-cADPR减少，说明W位点对ADPR环化十分重要。作者进一步比对种TIR结构域的序列，发现在可形成环化ADPR的蛋白中，W位对应的残基均为芳香族氨基酸，说明芳香族残基的出现可以促进环化ADPR的生成。再扩大分析范围，发现在种TIR结构域序列中，所有具有环化酶活性的TIR在对应位点均为芳香族氨基酸。突变体实验证实该位点出现芳香族氨基酸对环化ADPR产物产生的必要性。此前研究显示，cADPR异构体的产生可活化假炭疽杆菌（Bacilluscereus）Thoeris噬菌体防御系统中ThsA的NADase活性。于是作者测试本研究纯化的cADPR异构体是否可以直接活化ThsA，发现v2-cADPR可浓度依赖地活化Enterococcusfaecium的EfThsA和Streptococcusequi的SeThsA，而v-cADPR仅能在测试上限μM浓度时活化两种蛋白，ADPR和cADPR完全无法活化两种ThsA。此外，作者还使用等温量热滴定（ITC）确认v2-cADPR可直接结合非活性状态的EfThsA和自活化的AbThsA，Kd值分别为59.1±15.8nM、±1.6nM。那么v2-cADPR结合ThsA的分子机制是怎样的？为此，作者解析出BcThsA的SLOG结构域与v2-cADPR的复合物晶体结构，发现其中带有(1’’→3’)O-糖苷键的cADPR电子密度清晰可见，这与前述NMR分析相吻合。BcThsASLOG在溶液中呈稳定的二聚体形式，在晶体中形成对称的二聚体，其单体界面与不结合配体时是一致的。v2-cADPR的结合并未导致结构发生剧烈变化，位于临近二聚体对称界面一个高度保守的口袋区内，两个v2-cADPR的腺嘌呤间距仅4.5，通过两个水分子桥接起来。此外，v2-cADPR的不同基团还分别与蛋白上一系列氨基酸形成互作，共同稳定两者的结合；而带有(1’’→2’)O-糖苷键的v-cADPR缺失一个关键氢键作用，且其腺苷会与口袋边缘的残基产生空间位阻，这也解释为何ThsA倾向于被v2-cADPR活化。为揭示v2-cADPR活化ThsA的分子细节，作者又解析出不含配体的非活化状态SeThsA晶体结构，并将其与自活化状态的BcThsA结构及前面解析的BcThsASLOG:v2-cADPR复合体结构比较。晶体堆积分析显示，SeThsA呈D2对称四聚体，其核心包含两个SIR2二聚体被两侧的SLOG二聚体包夹着。与BcThsA比较，显示其SIR2二聚体转动约27°并移位约14，参与SIR2二聚体化的α3螺旋部分遮蔽推测的活性位点，构象也不同。与复合物结对比显示，v2-cADPR的结合可能诱发SLOG结构域取向和位置的变化，作者推测这种变化足以导致α3螺旋构象的解开，从而允许NAD+进入活性位点。此外，突变体实验证实SIR2二聚体界面对ThsANADase活性起调节作用。总之，v2-cADPR通过改变ThsA四聚体组织方式激活其NADase功能。最后，作者发现丁香假单胞菌（Pseudomonassyringae）效应蛋白HopAM1在转基因拟南芥中的表达可发挥免疫抑制作用，而该作用的实现需要v2-cADPR的产生，不受NAD+存在与否的影响。回顾全文，ADPR可通过形成O-糖苷键发生环化，产生v-cADPR和v2-cADPR。结构分析显示催化v-cADPR形成的TIR结构域蛋白经构象变化实现活性聚集，其方式类似TLR接头蛋白的自结合。TIR结构域发挥环化作用需要一个保守的色氨酸（或其他芳香族氨基酸）。V2-cAPDR是细菌抗噬菌体防御系统ThsA效应蛋白的活化因子，同时可促进病原菌效应蛋白抑制植物的免疫机制。总之，作者通过系统的研究揭示出cADPR异构体产生的分子基础及其在抗病毒和抑制植物免疫中的信号分子作用。原文链接：

转载请注明：http://www.hongminqing.com/msyrq/11299.html