脐带间充质干细胞制备基本器材和试剂
1.设备
超净工作台、倒置照相显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、解剖显微镜、共聚焦显微镜、电子显微镜、CO2培养箱、低速大容量多管离心机、普通冰箱、超低温冰箱、程序降温系统、制冰机、酶标仪、染色体分析系统、细胞计数仪、PCR仪、基因测序系统、凝胶成像系统、超滤系统、纯水系统、PH计、电子称、平衡称或天平、高速离心机、高压蒸气消毒装置、点热干燥箱、恒温水浴箱、微孔过滤器、移液器（1~0μl）。
2.消耗材料
T塑料培养瓶、T75塑料培养瓶、T25培养瓶、培养皿、塑料离心管（5ml、10ml、20ml、50ml、ml、ml）、EP管、细胞冻存管、一次性移液管、移液器枪头、乳胶手套、吸球、酒精灯、小型手术包（剪刀、镊子、眼科剪、眼科镊、止血钳、刀片等）、纱布、棉球、搪磁盘、杂物缸等。进入细胞工程实验室的所有耗材必须是无菌的合格产品。
3.主要试剂DMEM/F12培养基、EDTA-0.25%胰酶、NaHCO3、胎牛血清（FBS）、青霉素（80万U）、链霉素（万U）、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子、去离子无菌水、生理盐水、人血白蛋白、复方电解质冻存液、酒精、消毒液、pH试纸。进入细胞工程实验室的所有耗材必须是无菌的合格产品。
基础试剂的准备：
（1）6.6%NaHCO3溶液的配制：用电子天平称取NaHCO36.6g，加入灭菌注射用水定容至ml，在细胞层流室内超净工作台上用高压灭菌过的0.22μm的滤膜过滤除菌后备用。
（2）10%FBS的DMEM-F12培养液的配制：无菌条件下在ml基础DMEM-F12培养液中加入55ml胎牛血清，再用6.6%NaHCO3溶液调节pH值至7.4后备用。
（3）抗生素的配置：将青霉素（80万U/瓶）溶解于4ml灭菌注射用水中，链霉素（万U/瓶）溶解于4ml灭菌注射用水中，两者混匀后按照1ml/支分装备用，使用时每升培养液加入1ml。
（4）冻存液：含20%FBS和含10%DMSO的完全DMEM-F12培养液。
脐带间充质干细胞的原代培养
1.在无菌条件下取脐带一根，转移入50ml离心管中加入生理盐水反复冲洗3遍以上，最后用双抗水浸泡5~10分钟，用生理盐水冲洗干净后，在无菌的培养皿中，用镊子配合剪刀去除被膜、血管等，再用生理盐水冲洗去除血液和杂质。如果是制备临床应用细胞，必须是取自检查合格的脐带，最低检测标准至少应符合临床输血要求，HIV、HBV、HCV、梅毒、CMV检测为阴性的健康产妇。2.用高压灭菌过的眼科虹膜剪将组织分离为0.5cm长的组织块若干，再将组织块转移至一个1.5mlEP管内，用虹膜剪将EP管内的组织剪碎至糊状，一般使组织块在1mm3以下。3.加入等量DMEM/F12基础培养基，直接将EP管内的糊状组织接种于培养瓶中，一个EP管对应一个T的培养瓶，然后加入10ml已调整好pH值的含10%FBS的完全DMEM-F12培养液，轻轻晃动培养瓶使组织块均匀分散于培养瓶底部，然后放入5%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中静置于贴壁培养，期间避免振荡，目的是使富含间充质干细胞的组织充分贴壁。4.静置培养24小时后，在倒置显微镜下观察，组织块贴壁牢固后，可补加完全培养基10~15ml之后3~4天换1次培养液，静置培养7~9天后，可见大量细胞贴壁。此时，用吸管轻轻吸出一半培养液，轻轻摇晃培养瓶，使组织块脱离瓶底，吸弃上清和悬浮组织块并接种于新培养瓶中加入新鲜10%FBS的完全DMEM/F12培养液继续进行贴壁培养，密切观察细胞生长情况，依据细胞生长情况每隔3~4天换液1次。5.第1次贴壁培养成功并更换培养液时，可用吸管反复吹打，使微组织快脱落，再将脱落下来的组织块接种至相同面积的另一塑料培养瓶的瓶底进行贴壁培养。同一脐带组织块至少可反复进行3次重复贴壁培养，即可获得常规培养3倍数量以上的原代UCMSC。6.脐带组织块培养后2周左右，细胞可长满瓶底，达到80%以上融合，此时可用吸除培养基，加入适量0.25%的胰酶，充分摇晃均匀，置于37℃培养箱中放置5分钟，注意观察细胞形态变化，发现细胞收缩，摇晃培养瓶有片状细胞脱落时，立即加入含10%血清的培养液10~15ml终止反应，用吸管吹打使细胞完全脱落，然后将细胞悬液移入离心管中，~×g离心10分钟，再加入生理盐水10ml，离心洗涤，反复3次后，计数活细胞，用完全培养基稀释，收集细胞进行冻存或继续传代培养。传代培养的过程是纯化间充质干细胞的过程。7.传代培养通常采用专用细胞培养瓶，以DMEM/F12培养基为基础，按原代培养密度1∶3的比例进行传代培养。作者所在实验室创建了一种以脐带组织块培养法为基础的高效、大规模体外制备技术，组织块可反复接种培养3次以上，获得原代细胞的数量在1×个细胞以上，传代培养至第3代，可获得3.6×个细胞。8.长期在体外传代培养的是否会衰老、突变等一直是人们