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重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建两三组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。其中还是有基本的技巧需要掌握。在这里决定将我的心得分享于大家，以期能提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
在本文中将以一段pcr获得基因，以NdeI和HindIII位点克隆进入质粒为例来系统剖析重组质粒的构建中基本策略与技巧。这作的经验积累与心得。所涉及内容如下：1)克隆基因的酶切位点问题2)载体酶切的问题3)连接片段浓度比的问题以上阐明上述问题同时，本人尽可能引入实验时会各种出现的问题予以说明。一、克隆基因的酶切位点问题1对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识不赘述。这里对NdeI和HindIII为例。2设计PCR引物时的保护碱基数目。这可能是初涉入未引起注意与重视问题。NdeI需加入6个以上的保护碱基，而HindIII则要三个就可以。一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。如NdeI就属这类。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数：NcoI4NdeI6NheI3NotI8PmeI6SacI3SalI3SmaI3HindIII3BstI8SphI4XhoI3XbaI3SmaI4案例分析：本人最初用NdeI酶，未注意到该问题，只与普通酶一样引入两个保护碱基，一个月内没有进展。后查文献得知症结所在，加下六个后，迎刃而解。大家引以为戒啊。现在普通酶我都引入三个保护碱基，现在合成价格不贵，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重要实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。二、载体酶切的问题1 单切鉴定。这个问题实是简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，在实验开始之前对质粒载体很有作单切鉴定之必要。现在我每次构建之前，对所要用的酶切位点都作一一鉴定，比如要用到NdeI和HindIII，我就先对质粒该两个酶进行鉴定。有效地切开后，再将引物发出合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。2质粒双切后对照连接。实验中这是连接步骤，但实质还是质粒酶切问题。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但两种酶在通用缓冲液中中酶切效率不一样，可能导致部分只是单切缺口的质粒片段存在，这样，连接的对照实验在不加入外源片段时，质粒就会自连，长出菌斑，这种情况下，质粒酶切片段是不可能用于下一步真正连接实验。案例分析：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。案例分析：本实验室一个号称实验严谨的大博士，有KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。迁怒KpnI,在我不知情下扔掉实验室所满管KpnI酶。我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，反而责备本人不早说出问题原因所在。呵呵，他不自责自己只是闷头做实验，不早问，反倒咬一口解铃人。呵呵，你说冤不冤？
三、连接时两片段浓度比问题一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：10为宜。做好“一、二”，16℃10小时后，每次都能有效地连接上。当然还有感受态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，直接买公司现成的，用的也挺好。这里介绍一个估测DNA浓度的方法：DNA可以用紫外法检测，也可以电泳对比marker估测，在要求不是很精确情况下，大家不妨试试下面方法：1．取一平皿。2．薄薄倒一层含有EB的琼脂糖胶，凝固(4℃可以存一个星期)。3．平皿背面可以画成小方格。4．一小格中点1ul样品。5．另一小格格点1ulDNA标准品(我一般用TakaraDNAlander，1ul相当60ng)6．凉干后，紫外灯下根据亮度就可以估测了。OK，我连接时这么估测浓度，5分钟就要可以知道两片段浓度。其实连接片段浓度比可以允许在一个范围内，1：5至1：10都可以，所以上述估测方法在这种情况下是行得通的。
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