作者：医院检验科韦丽亚罗晓成
晨会结束，忙碌的一天又开始了，生化组工作对我们来说一点也不轻松。很多医生护士还有外行人，都羡慕我们，觉得我们都是用全自动的大仪器，放个标本上机，运行仪器就出结果了，逍遥又自在。其实不然，一个标本从接收到发结果，要做好检测前、中、后质量控制，才能得到一个真实可靠的检验结果。今天就讲讲一个分析后的案例。
审核结果时我们发现有一例儿科病人的CK测不出来，心肌酶结果除了肌钙蛋白以外其他项都偏高。查看病人是疱疹性咽峡炎入院。我第一反应就是可能超仪器线性了，需要稀释检测。我拿出病人标本稀释20倍，和原血清同时检测，结果发现稀释20倍结果得u/l，原血清u/l。为什么结果相差那么多呢？我们又对标本做了5倍，10倍，30倍稀释，结果如下：
我们该如何解释这样的结果？
我们该如何发这个病人的结果？
幸好现在网络发达，我们医院的宁老师。
宁老师看了这个病人反应曲线之后，给我们答复是：这个病人CK应该很高的，测得原血清U/L那个结果是发生了底物耗尽，20倍稀释的结果应该比较准确。
他建议我们查看反应曲线。速率法的反应曲线，在计算浓度的那一段，必须是直的，不能有拐点。如果有拐点，就是底物耗尽的表现。
这是未稀释的曲线。明显有拐点。说明有底物耗尽。20倍稀释的曲线没有拐点。
于是我们把稀释20倍的结果发了出去。我们认真看曲线又发现，稀释5倍和稀释20倍的曲线看起来差别不大，都没有拐点了，为什么结果还是有差别呢？
稀释5倍的曲线
稀释20倍的曲线
宁老师耐心地给我们解释：
1.一般来说，很少有CK的试剂线性范围超出的，5倍稀释那个结果接近，肯定不可靠。不过从反应曲线来看，确实不明显，也没有报警旗标，可跟国产试剂限定条件未严格设置有关。
2.底物耗尽，曲线肯定会有拐点。但是介于超出线性与底物耗尽之间的，只能通过参数设置中的吸光度限定来发现。如果是原装试剂，参数设置中科学的设置了吸光度限制，超出线性就会有※报警。而且，可以设置仪器出现此类报警不传输数据，就可以避免发出错误的报告。
3.关于10倍、20倍、30倍到底报哪个结果，这其实涉及到可报告范围的验证。如果你们实验室做了可报告范围验证，这个问题你们就不会纠结了……
原来如此！宁老师寥寥数语，就让我们学习到很多实用的知识！
我们科室使用的CK线性范围是2.5~U/L，CK读点时间是32~40秒，CK浓度太高导致底物耗尽，反应变得平缓了，但仪器计算结果是根据已经变得平缓了的反应曲线计算出一个较低的结果，可能是几百，也可能是几十，也可能测不出。其实这样的底物耗尽现象在日常工作中并不少见，由于我们仪器没有报警旗标，再加上有的结果与正常结果没有明显的差异，很容易被我们忽视了。
我们想起昨天遇到的另一个心衰患者，CK结果也是测不出来。我们立即查看病人历次结果，入院初期CK稀释后都是6万多，最近两次CK结果为、U/L。昨天的结果经过稀释后5万多。我们马上想到，这也是典型的底物耗尽的表现。果然，询问当班同事，他说、U/L这两次是没有稀释直接检测得的结果。
何为底物耗尽？
如何让我们的同事在工作当中快速监测出底物耗尽？
监测出来以后如何处理？
带着深深的疑惑，我们渴望去了解更多…
在动力学法检测的生化反应中，由于标本酶含量过高，导致反应底物短时间内消耗殆尽，使得之后的反应吸光度变化近乎为零，反应曲线成为一段较为平坦曲线，其斜率不符合实际情况，所得结果也不符合真实值，这种现象称为底物耗尽。
酶促反应不同于一般催化反应，反应不是瞬间完成的，而是经过一个进程。酶分子要和底物分子结合，然后才催化底物反应。
反应开始时，酶与底物分子结合很少，反应速度很慢，底物或产物的变化量与时间不成正比，这一时期称为延迟期。延迟期的时间一般为数秒钟到数分钟，在参数设置时，吸光度读点时间都会选择在启动反应试剂（双试剂时，为试剂二）加入一段时间之后；随着时间的推移，酶与底物分子结合增多，反应速度加快，底物或产物的变化量与时间成正比，这一时期称为线性期（也称零级反应期）。按照其试剂的特性，确定线性期读点时间，极为重要；随着底物的减少和产物的增加逆反应增强，反应速度减慢，偏离线性期。
速率法检测酶类底物耗尽解读：
1.酶类项目检测的试剂盒，不同厂家提供的试剂线性范围与试剂的质量有直接关系。但绝大部分试剂盒所含的底物浓度在一般情况下是足够大的，可以满足绝大多数临床标本的实际检测需要。
2.当人体肝脏、心脏等损伤特别严重时，ALT、AST、CK等酶的释放会使得血中的浓度大幅度上升，但通常这些酶活性不会超过试剂盒所提供的检测线性范围。所以绝大多数检测结果是可靠准确的。但是当器官损伤特别严重，样本中酶的含量远远大于试剂检测的线性范围，也就是零级反应期非常短，不能有效完成速率法检测，此时的检测结果是无效的、不准确的。
3.实际工作中，底物耗尽可分为两种情况：
3.1样本中酶活性大大超过线性范围时，底物在瞬间被耗尽。也就是零级反应期极短，速率法检测所设定的吸光读点完全不在零级反应期，即反应界限内的吸光度点数为零。那么结果可能出现测不出或者出现负值(容易被发现)，如本案例中第一次结果未测出。
3.2.样本中酶的活性超过线性范围较多时，但低于上述极端过量情况，底物在很短时间内被耗尽。也就是零级反应期较短，速率法检测所设定的吸光度读点仅有几个点在零级反应期，此时会造成结果严重偏低(不易被发现，可能导致严重后果)。就如前面所述的案例CK检测结果、U/L，单独看此次结果为正常结果，但监控其反应曲线，发现该反应有底物耗尽现象，如果我们不能及时发现并处理，很容易报出被大幅度降低的检测结果，会严重影响病人的诊断与治疗的及时性。
底物耗尽的监测与处理：
1.设置完善的生化分析仪监测报警功能，无论是在吸光度呈升高还是下降的酶促反应中，合理地设置吸光度的最高限值或最低限值。如果限值设置不合理，就失去了对检测结果的正确性做出相应的判断并对异常结果发出报警的功能。
2.检测吸光度各个读点应全部设置在有效酶促反应界限内，如有一点超出界限，就应报警，以便及时得到处理。
3.如分析仪并没有发出报警信息，应结合查看检测结果的反应曲线图进行分析，判断本次结果是否真实可靠。
4.有文献研究显示[1]，利用HBDH/LDH比值可以用于发现HBDH和转氨酶的底物耗尽，尤其利于发现容易被忽略的转氨酶底物耗尽情况。LDH＞U/L且比值＜0.8时，LDH升高主要来源于肝脏损伤，需要同时查看HBDH、ALT、AST曲线；当LDH＞U/L且比值＞0.8时，LDH升高主要来源于心肌损伤，需要同时查看HBDH、AST曲线，确认是否存在底物耗尽。
5.对于存在“底物耗尽”现象的反应，凡速率法(AMY、ALP、AST、ALT、CK、LDH等)皆有可能存在此现象，如存在“底物耗尽”现象，应当适当稀释标本，结果乘以稀释倍数，稀释倍数以稀释反应无底物耗尽现象的倍数为稀释倍数[2，3]。
6.以往我们知道实验误差70%主要来自分析前，也比较重视实验分析前、分析中质量控制，有学者发现分析后质量控制占总误差18.5%-47%[4]。分析后的质量控制包括：检验结果的审核、结果的发放、危急值报告制度、结果的临床评估及信息的反馈、实验室数据管理、实验室生物安全等。因此生化检验分析检测应将分析后质量控制重视起来，为临床提供更真实可靠的诊断依据。
参考文献：
[1].万祥辉,杨细媚,银天娇,等.α-羟丁酸脱氢酶与乳酸脱氢酶比值在发现α-羟丁酸脱氢酶和转氨酶底物耗尽中的应用研究[J].实验与检验医学,(6):-.
[2].谭丽芳,肖建美,肖拥军.30例ALT严重底物耗尽现象的探讨[J].实用医技杂志,,15(20):-.
[3].黄志伟.AST动力学法测定时底物耗尽现象浅析[J].分子诊断与治疗杂志,,17(2):30-32.
[4].黄青平,张文梅,李娟.临床生化检验应重视分析后质量控制[J].医药前沿,(25):-
