结肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，其发生率呈逐年上升趋势。化学药物治疗是结肠癌治疗的重要方法之一。青藤碱（ｓｉｎｏｍｅｎｉｎｅ，ＳＩＮ）为防己科植物青风藤中提取的生物碱单体，长期应用于临床，具有很好的安全性。近年来的研究表明青藤碱在体外对多种肿瘤具有抑制作用，但其对结肠癌作用的研究不多。本实验以体外培养人结肠癌ＳＷ４８０细胞为研究对象，观察盐酸青藤碱对ＳＷ４８０细胞增殖和细胞周期的影响，为结肠癌的防治提供新策略。
材料与方法1.材料：盐酸青藤碱纯品由湖南正清制药集团有限公司惠赠。人结肠癌ＳＷ４８０细胞由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。Ｌ－１５培养液、胰蛋白酶购自美国Ｇｉｂｃｏ公司。小牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。ＣＣＫ－８、细胞周期与凋亡试剂盒购自碧云天生物技术研究所。
2.方法（１）细胞培养与传代：ＳＷ４８０细胞常规培养于含１０％热灭活新生小牛血清、青霉素１００Ｕ／ｍｌ和链霉素１００Ｕ／ｍｌ的Ｌ－１５培养液中，置于３７℃的细胞培养箱。细胞呈单层贴壁生长，实验和传代均取对数生长期细胞。（２）盐酸青藤碱工作液配制：盐酸青藤碱，分子式：Ｃ１９Ｈ２４ＣｌＮＯ４，分子质量３６５．８５，为白色针状结晶粉末。将３．６６ｇ盐酸青藤碱溶于１００ｍｌＰＢＳ液中，配成１００ｍｍｏｌ／Ｌ的贮存液，保存备用。使用时以细胞培养液稀释成工作浓度。
（３）细胞增殖抑制试验（ＣＣＫ－８法）：取对数生长期细胞，用０．２５％的胰酶消化，调整细胞悬液浓度至２×１０５个／毫升，每孔加入１００μｌ接种至９６孔板，置于密封盒，３７℃细胞培养箱培养。细胞贴壁后，吸弃上清，换上各浓度组盐酸青藤碱（１、２、４、８、１２、１６、２０ｍｍｏｌ／Ｌ）处理细胞，每组设５个复孔，同时设不含细胞仅有培养基的调零组和０ｍｍｏｌ／Ｌ盐酸青藤碱的阴性对照组，继续培养２４、４８和７２ｈ后用酶标仪在波长４５０～６００ｎｍ处测定吸光度Ａ值。取平均值计算药物作用后肿瘤细胞生长抑制率，公式如下：细胞生长抑制率（％）＝（１－干预组吸光度平均值／对照组吸光度平均值）×１００％。以药物浓度为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标，绘制生长抑制曲线，根据曲线获得ＩＣ５０。
（４）流式细胞术检测盐酸青藤碱对ＳＷ４８０细胞周期的影响：收集实验组和对照组细胞，用ＰＢＳ洗涤后离心３次，用７０％冰乙醇在－２０℃冰箱固定２４ｈ，离心去乙醇，ＰＢＳ洗涤２次，１０００ｒ／ｍｉｎ离心，弃上清液。加入ＲｎａｓｅＡ（５０μｇ／ｍｌ）３７℃温育３０ｍｉｎ后，加１０μｌＰＩ（５０μｇ／ｍｌ）置４℃避光作用２０ｍｉｎ。用流式细胞仪计数１００００个细胞，在激发波长４８８ｎｍ波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用ＣｅｌｌＱｕｅａｔＰｒｏ软件进行细胞ＤＮＡ含量分析和光散射分析。（５）光镜、电镜观察细胞形态：倒置显微镜下观察各浓度组盐酸青藤碱（１、２、４、８、１２、１６、２０ｍｍｏｌ／Ｌ）处理ＳＷ４８０细胞２４、４８和７２ｈ后的细胞形态学变化。透射电镜（型号，ＣＭ１２０，Ｐｈｉｌｉｐｓ）观察细胞超微结构变化：收集０和１０ｍｍｏｌ／Ｌ盐酸青藤碱处理ＳＷ４８０细胞４８ｈ后的细胞，２．５％戊二醛４℃前固定，１％锇酸后固定，梯度乙醇、丙酮脱水，６１８环氧树脂浸透包埋，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅染色，透射电镜下观察。
结果１．ＣＣＫ－８法检测盐酸青藤碱对ＳＷ４８０增殖的影响：不同浓度盐酸青藤碱作用于人结肠癌ＳＷ４８０细胞后，随着时间的延长和浓度的增加，盐酸青藤碱对其增殖的抑制作用也随之增强，见图１。ＳＩＮ对于人结肠癌ＳＷ４８０细胞的２４、４８、７２ｈ的半数抑制浓度（ＩＣ５０）分别为１１．３８、１０．０４、８．５３ｍｍｏｌ／Ｌ。
２．ＳＩＮ对ＳＷ４８０细胞周期的影响：以０、４、８、１０、１６ｍｍｏｌ／Ｌ的ＳＩＮ干预４８ｈ后，ＳＷ４８０细胞呈浓度依赖性细胞周期分布。在４和８ｍｍｏｌ／Ｌ时，Ｇ１期百分比与阴性对照组（０ｍｍｏｌ／Ｌ）相比明显增加，Ｓ期及Ｇ２期的细胞比例较阴性对照组降低。在１０和１６ｍｍｏｌ／Ｌ时，Ｇ１期和Ｇ２期的细胞百分比与阴性对照组相比均明显增加，说明高浓度的ＳＩＮ可同时诱导ＳＷ４８０细胞Ｇ１和Ｇ２期阻滞，详见图２。同时，用１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＳＩＮ作用ＳＷ４８０细胞２４、４８、７２ｈ，随着干预时间的延长，Ｇ１期比例亦逐渐增加，Ｓ期及Ｇ２期的细胞比例较２４ｈ明显降低，再次说明ＳＩＮ可诱导ＳＷ４８０细胞的Ｇ１期阻滞，并呈时间依赖性，详见图３。
３．ＳＩＮ对ＳＷ４８０细胞形态学的影响：倒置显微镜下观察细胞形态学变化可见不同浓度ＳＩＮ作用ＳＷ４８０细胞后，随着浓度和时间递增，细胞数目明显减少，同时细胞形态发生变化，细胞出现凋亡和死亡。透射电镜观察，用１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＳＩＮ作用ＳＷ４８０细胞４８ｈ后有凋亡细胞出现，其特征表现为细胞表面微绒毛消失，胞质浓缩，内见空泡形成，胞膜起泡或“出
芽”。核染色质固缩，凝集成块状或边移于核膜下。凋亡早期个别细胞线粒体基质肿胀，颜色变淡。凋亡晚期细胞线粒体嵴减少甚至消失，并见凋亡小体，见图４。
讨论青藤碱是中药青风藤提取的生物碱单体，具有抗炎、镇痛、抗风湿、免疫抑制、降压、抗心律失常等作用。已有正清风痛宁片、盐酸青藤碱注射液、毛青藤总碱片等制剂长期应用于临床，用于治疗类风湿性关节炎等各种风湿病以及心律失常取得较好疗效，具有很好的安全性。近年来的研究表明，青藤碱对一些肿瘤（如肺癌、肝癌、前列腺癌、宫颈癌）具有抑制作用，但尚缺乏其对结肠癌作用及机制的研究。本研究通过ＣＣＫ－８实验证实盐酸青藤碱在体外对人结肠癌ＳＷ４８０细胞具有明显的抑制作用，该作用呈浓度、时间依赖关系。随着ＳＩＮ干预浓度和时间的递增，ＳＷ４８０细胞数目明显减少，同时细胞形态发生变化，细胞出现调亡和死亡。
细胞周期是一个复杂有序并受严格调控的过程，肿瘤的发生与细胞周期的紊乱密切相关。细胞周期紊乱可引起细胞生长失控、分化受阻、凋亡异常，导致细胞的无限增殖。细胞通过细胞周期的两个限制点Ｇ１～Ｓ期和Ｇ２～Ｍ期保证细胞复制。姜廷枢等的研究表明，青藤碱体外能有效抑制肺癌细胞生长，其机制与其阻滞细胞周期于Ｇ１期、诱导细胞凋亡有关。龚立等的研究表明青藤碱对肝癌ＨｅｐＧ２细胞的生长有明显抑制作用，并诱导肿瘤细胞发生凋亡，使细胞周期阻滞于Ｇ１期和Ｇ２期。目前尚无ＳＩＮ对结肠癌作用的研究报道。本研究结果显示，低、中浓度的ＳＩＮ（４、８ｍｍｏｌ／Ｌ）作用ＳＷ４８０细胞４８ｈ后，可引起人结肠癌ＳＷ４８０细胞Ｇ１期百分比增加，而高浓度的ＳＩＮ（１０、１６ｍｍｏｌ／Ｌ）作用４８ｈ后，Ｇ１期和Ｇ２期细胞百分比均明显增加，说明ＳＩＮ可诱导ＳＷ４８０细胞的Ｇ１期阻滞，并呈浓度依赖性，在高浓度时还可诱导ＳＷ４８０细胞的Ｇ２期阻滞。另外用１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＳＩＮ干预ＳＷ４８０细胞２４、４８、７２ｈ，随着干预时间的延长，同样观察到ＳＷ４８０细胞的Ｇ１期百分比增加，再次说明ＳＩＮ可诱导ＳＷ４８０细胞的Ｇ１期阻滞，并呈时间依赖性。
综上所述，体外实验表明盐酸青藤碱对人结肠癌ＳＷ４８０细胞增殖具有抑制作用，其机制可能与其诱导的细胞周期Ｇ１期和Ｇ２期阻滞有关。本研究为盐酸青藤碱应用于临床治疗结肠癌提供了实验室依据，但尚需进一步研究其体内抗肿瘤作用及机制，评估其抗肿瘤效果。
来源：杨海波施展等，青藤碱对人结肠癌细胞株ＳＷ４８０增殖和细胞周期的影响，医学研究杂志２０１４年第７期
-END-
扫一扫下载订阅号助手，用手机发文章赞赏
