酶标仪可以用来做什么？
测酶活，测细胞或者ELISA?
或许，它还可以做一些更高级的东西。
比如，
利用FRET检测转录因子引起的DNA弯曲，
甚至在线模拟
蛋白质与DNA的结合、解离速率。
让我们一起看看
ThermoScientificVarioskanLUX
如何利用FRET测量DNA弯曲
以及蛋白质与DNA的相互作用
ThermoScientificVarioskanLUXMultimodeMicroplateReader
引言SRY-relatedbox（简称SOX）是一类存在于人类基因组中的转录因子，它们特异性地与CATTGTC样的基因序列结合，调控多种发育相关基因的表达。SOX蛋白包含一个高迁移率族（HMG）DNA结合结构域，这个结构域可以与DNA双链的小沟相互作用，使DNA链发生弯曲。研究表明，SOX转录因子与DNA的结合可能使染色质结构发生改变，进而启动细胞类型特异性的调控复合物或增强子的装配，所以精确的弯曲拓扑结构和结合、解离速率是SOX转录因子进行基因调控的关键。本研究利用纯化的SOX18HMG蛋白与同源SOXProx1DNA片段进行荧光共振能量转移（FRET）试验，分析了SOX蛋白与DNA相互作用中的DNA弯曲及蛋白质-DNA结合动力学。
材料与方法
?VarioskanLUX多功能酶标仪
?重组SOX18HMG蛋白
?偶联荧光基团的15bpProx1基因调控序列，以不偶联荧光基团的DNA序列作为对照。
弯曲试验退火合成三组双链DNA，DO组只含有cy3供体荧光基团，AO组只含有cy5受体荧光基团，DL组为cy3和cy5双荧光标记的DNA双链。然后将DNA样品分为2份，一份加入重组蛋白，另外一份不加，混合在1xFRET缓冲液中（如图1A）。
按图1B制备样品，其中DNA浓度为60nM，SOX18HMG蛋白浓度为nM，放入VarioskanLUX进行检测。
图1FRET实验示意图
注：(A)反应液的准备与分组；(B)DNA片段和SOX18HMG蛋白，样品板制备，吸收光谱与发射光谱原理图；(C)SOX18HMS结合前后DNA5‘端荧光基团距离的变化。FRET光谱设置a．供体激发扫描：激发光波长nm，扫描-nm间的发射光，包含～nm的供体发射光和～nm的受体发射光。
b．受体激发扫描：激发光波长nm，扫描-nm间的发射光，带宽设置为5，测量时间设为10-ms。
FRET动力学检测进样器清洗：依次用75%乙醇，ddH2O，蛋白储存缓冲液清洗酶标仪进样器，上样前打掉管路中所有液体，确保进样器充满上样溶液。
反应体系：5xFRET缓冲液6mL，DNA探针终浓度50nM，根据加入的蛋白溶液体积将反应体系用ddH2O补足30mL。
放置样品板，把蛋白溶液加入到进样器中，在VarioskanLUX软件中选择样品板类型及布局，如下图设置检测方案。
结果与讨论当SOXHMGbox与DNA结合时，DNA片段两侧的5‘末端间的距离会由于弯曲而发生改变（图1C）。因此，如果将两个能发生荧光共振能量转移的荧光基团偶联到DNA的5‘末端，那么当DNA发生弯曲时，就可以观察到荧光共振能量转移现象。
图2FRET光谱和时间分辨结合试验
注：(A)SOX18HMG蛋白与双链DNA结合前后的光谱图。绿色曲线代表与蛋白结合前的纯DNA样品，蓝色曲线代表与SOX18HMG蛋白结合后的DNA样品。AO代表仅含受体荧光基团的对照样品，DO代表仅含供体荧光基团的对照样品，DL代表双荧光标记的Prox1双链DNA。(B)时间分辨性地测量SOX18HMG蛋白与Prox1DNA结合的FRET效应。图2A可以看出：
?与未结合蛋白的DNA相比，SOX18HMGbox与15bpProx1DNA片段结合时，供体发射光明显减少，受体发射光增加。
?用cy3和cy5荧光基团单独标记DNA片段，结果显示SOX18HMG并没有使荧光发生明显的猝灭或增强，说明所观察到的光谱变化是真实的FRET效应，可以准确估计DNA实际的弯曲角度。
图2B可以看出：
?用VarioskanLUX可以很好地测定SOX18HMG与Prox1DNA的快速结合。通过优化设置，动态测量的死时间可以控制在20ms内，能够准确模拟蛋白质与DNA相互作用时的结合、解离速率。
总结?VarioskanLUX非常适合用于FRET法研究DNA与转录因子的相互作用，可以准确评估DNA的弯曲角度及蛋白质与DNA的结合、解离速率；
?VarioskanLUX特有的带宽可调功能，使得激发和发射波长最小间隔低至18nm；
?本实验中描述的FRET实验可以用于研究其他的转录因子，RNA结合蛋白，从DNA到核小体的组装，也可以用于高通量筛选SOX转录因子与DNA相互作用的抑制剂。更多VarioskanLUX细节，北京一般治疗白癜风多少钱北京中科中医院好不好