大家好！今天分享的文章是“Cloningandcharacterizationofα-L-rhamnosidasefromChloroflexusaurantiacusanditsapplicationintheproductionofisoquercitrinfromrutin”。该文在年3月发表于BiotechnolLett,作者是Kyung-ChulShin等人。
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引言
异槲皮素是一种植物黄酮类化合物槲皮素-3-O-葡萄糖苷，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗糖尿病和抗过敏活性。因其具有更高的水溶性，能被更好的肠道吸收，显示出比槲皮素更高的生物活性。但异槲皮素在自然界中含量较低，价格昂贵。因此利用芦丁生物催化生成异槲皮素十分迫切。从嗜热菌中提取的酶已被用于生产研究，它们通常具有更高的稳定性和活性。因此，在本研究中，作者从温泉中分离出的嗜热光全绿丝菌中克隆了一种鼠李糖苷酶。该酶比商业上的α-L-鼠李糖苷酶具有更高的水解活性，并用于芦丁生产异槲皮素的研究。
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成果
本研究旨在鉴定来自嗜热光全绿丝菌的重组α-L-鼠李糖苷酶，并将该酶应用于芦丁生产异槲皮素工艺。首先克隆α-L-鼠李糖苷酶并在大肠杆菌BL21中表达，并纯化为可溶性酶。纯化的α-L-鼠李糖苷酶的分子量大约为kDa，预计将以kDa的二聚体形式存在。在报道的异槲皮素生产中，纯化的酶对芦丁的比活性最高。在优化的pH6.0、50℃，0.6U/mLα-L-鼠李糖苷酶和30mM芦丁的条件下，异槲皮素的生成率为％。
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图文解读
图1：来自嗜热光全绿丝菌的α-L-鼠李糖苷酶的SDS-PAGE分析和分子量测定。每个纯化步骤的所有蛋白质条带都用考马斯蓝染色以进行可视化。A泳道1：Mark；泳道2:细胞粗液；泳道3：粗酶液；泳道4：纯化酶。B通过凝胶过滤色谱法测定来自嗜热光全绿丝菌的a-L-鼠李糖苷酶的分子量。纯化的a-L-鼠李糖苷酶通过HiPrep16/60SephacrylS-HR柱用0.5ml/min流速（mMNaCl）50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH6.0)洗脱。
图2：来自嗜热光全绿丝菌的α-L-鼠李糖苷酶的活性随pH和温度的变化。A:pH值的影响。用1mM芦丁和5%DMSO在50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液（pH4–8）中50°C下反应30分钟。B:温度的影响。在50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，用1mM芦丁和5%DMSO在30-70°C下反应30分钟。数据以三次重复实验的平均值表示，误差线由标准偏差表示。
图3：来自嗜热光全绿丝菌的α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性。将酶在30（实心三角形）、40（空心正方形）、50（实心正方形）、60（空心圆）和70°C（实心圆）下50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液（pH6.0）中孵育，最后在50°C下用50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH6.0)、1mM芦丁和5%DMSO反应30分钟进行测定。将实验数据应用于一阶曲线拟合，并使用SigmaPlot10.0软件计算半衰期。数据以三次重复实验的平均值表示，误差线由标准偏差表示。
图4：在酶和底物浓度变化的情况下，来自嗜热光全绿丝菌的α-L-鼠李糖苷酶催化芦丁生成异槲皮素的效率。A：酶浓度变化的影响。用20mM芦丁和5%DMSO在50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，50°C反应90分钟。B:底物浓度变化的影响。用0.6U/ml酶和5%DMSO在50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，50°C下反应90分钟。异槲皮素产量和转化率分别用实心圆和空心正方形表示。数据以三次重复实验的平均值表示，误差线由标准偏差表示。
图5：来自嗜热光全绿丝菌的α-L-鼠李糖苷酶催化芦丁（空心圆）生产异槲皮素（实心圆)。在50°C下，用0.6U/ml酶液、30mM芦丁和5%DMSO在50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH6.0)中进行反应。数据以三次重复实验的平均值表示，误差线由标准偏差表示。
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总结来自嗜热光全绿丝菌的α-L-鼠李糖苷酶被克隆、表征并应用于从芦丁生产异槲皮素。在最佳条件下，2小时后被来自嗜热光全绿丝菌的α-L-鼠李糖苷酶从芦丁完全转化为异槲皮素，生成量为15mM/h。因此，来自嗜热光全绿丝菌的α-L-鼠李糖苷酶是一种将芦丁生产为异槲皮素的有效酶。
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参考文献
