年年底，结构生物学经历了一场“分辨率革命”，许多生物大分子的神秘面纱纷纷被揭开。冷冻电子显微镜（以下简称“冷冻电镜”）是结构生物学的重要研究工具、重要突破，其结构解析的分辨率已从纳米尺度进入埃尺度（即原子尺度），成为可以与X射线晶体学相媲美的结构解析方法。其中，单颗粒冷冻电镜技术大大降低了结构解析的难度，提高了结构解析的速度。通过冷冻电镜技术，研究人员可以揭示许多之前未能知晓的生物分子细节，帮助人们揭秘众多的生物学现象。
文/张凯铭李珊珊
年，在新型冠状病毒（以下简称“新冠病毒”）基因序列公布之后的几个月内，重组表达的刺突糖蛋白、核蛋白的部分结构已被解析。然而，完整的病毒结构、结构蛋白在病毒上的原位全长结构、分布规律、拷贝数及与其他结构蛋白的相互关系仍然是迷雾。年8月至9月间，英国剑桥大学、德国马克斯普朗克研究所、清华大学的研究人员相继解析了新冠病毒原位结构，让大家清楚看到真实的病毒形象。我们课题组借助冷冻电镜技术，在透射新冠病毒的结构和解析分辨率上实现了重大突破，在推进冷冻电镜技术革新的同时，也协同促进结构病毒学的发展。
解析Anti-CRISPR对Csy
复合物的抑制机制
截至目前，研究人员已经鉴定出多种Anti-CRISPR蛋白。其中，最早被研究人员鉴定出的Anti-CRISPR蛋白作用于I-F型CRISPR-Cas系统（I-F型CRISPR-Cas系统也被称作Csy复合物）。已有研究对Csy复合物中的AcrF1、AcrF2、AcrF10蛋白结构以及对应的抑制机制进行了阐述，但是其他类的Anti-CRISPR蛋白，如AcrF9、AcrF8和AcrF6识别并抑制CRISPR-Cas系统的机制尚不清楚。
我们课题组与哈尔滨工业大学生命科学学院黄志伟教授课题组合作，通过冷冻电镜技术揭示了AcrF9、AcrF8和AcrF6对Csy复合物的抑制机制。相关研究成果于年3月31日发表在《美国科学院院刊》（PNAS）上。
借助单颗粒冷冻电镜技术，我们共同解析了AcrF9、AcrF8、AcrF6与Csy复合物的结构，分辨率分别为0.纳米、0.纳米、0.纳米。其中，分辨率为0.纳米的Csy-AcrF9复合物结构揭示了Csy复合物在近原子级别上相互作用的结构细节，并首次显示部分区域内存在水分子的相互作用（见图1）。通过类似的结构生物学以及体外活性检测实验，我们发现，AcrF8与Csy复合物螺旋骨架上的不同位置结合并与crRNA相互作用，从而抑制crRNA对DNA底物的识别。与前两者不同，AcrF6与Csy的Cas7.6f和Cas8f亚基之间的交界处结合，从而抑制了DNA双链解旋。这一研究成果为深入了解Anti-CRISPR蛋白对Csy复合物的抑制机制以及设计靶向Csy复合物的基因编辑工具提供了结构基础。
解析miRNA加工过程中的
重要机制
miRNA是一类重要的基因表达调控因子，在细胞发育、分化、衰老等生物学过程中发挥着至关重要的作用。起初，miRNA在细胞核中是一种微小的折叠发夹结构，被称为初始miRNA（pri-miRNA）。pri-miRNA是伴随基因组DNA的转录而产生的长度为数千个碱基的miRNA，其核心部分为茎环结构，而发挥功能的区域处于茎环结构的双链区。细胞借助“微处理器”复合物来识别并加工pri-miRNA，最终形成成熟的miRNA。其中，“微处理器”复合物包含1个Drosha和2个DGCR8蛋白，Drosha是核心催化组分，DGCR8为双链RNA结合蛋白，负责招募pri-miRNA底物。Drosha会切割pri-miRNA的基底部，生成miRNA前体（pre-miRNA）。随后，miRNA前体再经细胞质内的加工形成成熟的miRNA。成熟的miRNA及RNA诱导沉默复合物（RISC）与细胞质中的信使RNA（mRNA）相互作用，抑制翻译过程，阻止蛋白质的生成。尽管对miRNA加工过程已有研究，但对“微处理器”的蛋白结构仍然知之甚少，需要进一步地研究去了解miRNA的功能和调控机制。
基于此，我们课题组对miRNA加工机制做了进一步解析。结果显示，Drosha/DGCR8复合物通过内部的多种结构域协作特异性识别并精确加工pri-miRNA，完成对miRNAs的核内加工过程。相关研究成果于年5月7日发表在《分子细胞》（Molecularcell）杂志上。
在该研究中，我们解析了pri-miRNA处于部分结合以及完全结合状态下的两个结构。当Drosha的螺旋带（HB）结构域翻转，并与Drosha的C-端结构域、楔形结构域、RNA结合结构域紧密结合后，pri-miRNA会从部分结合状态转变成全结合状态。Drosha和DGCR8的双链RNA结合结构域（dsRBD）锁定在长度约35bp的pri-miRNA双链茎部结构区域内，而DGCR8的血红素结合域（HBD）则围绕pri-miRNA的顶环结构内，这样可以促使Drosha/DGCR8复合物特异性识别pri-miRNA。RIIIDa和RIIIDb催化区域与pri-miRNA的茎部双链区结合，pri-miRNA的底部双链RNA、游离单链RNA由Drosha的螺旋带状结构域和楔形结构域围绕。
RNA三维结构的
快速测定
作为“中心法则”的中间分子，RNA一般被折叠成复杂的三维结构以维持自身的稳定性，在无须依赖其他蛋白的前提下，RNA可参与基因转录、催化反应等生物学过程。人类基因组的80%会被转录为RNA，但是仅有1.5%的RNA编码蛋白质。目前，在蛋白数据库中解析的RNA结构不足个，主要是通过X射线晶体学和磁共振获得的。然而，RNA分子构象的异质性较大，尤其是在缺乏蛋白因子的情况下，X射线晶体学和磁共振这些传统技术难以确定RNA的结构。冷冻电镜技术的迅速发展推动了结构生物学的进步。其中，单颗粒冷冻电镜技术在重构蛋白、RNA方面优于传统技术。然而，因RNA分子通常太小且构象不均一，使用单颗粒冷冻电镜技术来解析纯RNA结构的进展相对缓慢。目前，已有研究显示，分辨率高于1纳米的纯RNA冷冻电镜结构仅有1个。
就如何快速解析RNA分子的冷冻电镜结构，我们经过不断地尝试得到一种可以准确并快速获得高分辨率的纯RNA分子结构的突破性方法——Ribosolve，破解了RNA分子结构解析的难题。相关研究成果于年7月3日发表在《自然方法》（NatureMethods）杂志上。
Ribosolve整合冷冻电镜、生化方法M2-seq和计算机建模工具auto-DRRAFTER于一体，对RNA的结构进行高分辨率解析。具体而言，我们首先通过冷冻电镜技术解析中等分辨率的RNA结构，然后通过M2-seq方法精确测定RNA的二级结构，最后借助计算机建模工具auto-DRRAFTER进行建模。从时间上来说，Ribosolve可以在较短的时间内快速解析RNA结构。基于Ribosolve，我们共解析11个RNA结构，碱基长度在60nt与nt之间，包括核糖开关（riboswitch）、核酶（ribozyme）和人工合成的RNA。虽然通过Ribosolve解析的RNA结构的分辨率未达到原子级别，但可以呈现出分辨率在0.10～0.47纳米的RNA分子的整体三维结构。基于此，研究人员可以分析RNA与其他因子结合引起的构象变化，并验证已预测的RNA结构的准确性。总之，Ribosolve为RNA及类似结构的解析提供了新的研究方向，打破了传统技术在结构解析方面的限制。
解析分子量最小的
RNA结构
冷冻电镜技术在解析新冠病毒方面也发挥了重要作用，成为研究病毒结构与功能的重要技术手段。许多新冠病毒蛋白的三维结构已经被解析，大大促进了靶向药物的研发进程。然而，我们对冠状病毒的了解还很有限，尤其是对RNA结构的认识还远远不够。与其他RNA病毒一样，新冠病毒RNA的结构对调节病毒复制、基因表达至关重要。尽管最近有研究人员发表了新冠病毒基因组与转录组数据，但目前针对新冠病毒中RNA结构的预测数据相对较少，而大多推测的调控序列还尚未被鉴定。
已有研究显示，新冠病毒的5UTR、3UTR和移码刺激元件（FSE）在病毒复制周期中起到至关重要的作用。FSE在开放阅读框ORF1a/ORF1b边界附近，可以使核糖体移码1个碱基，从而使其绕过ORF1a末端的终止密码子，进入ORF1b继续编码蛋白。病毒的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）就是靠这种方式编码的。然而，FSE的三维结构尚不清楚，作用的分子机制也不明确。
我们课题组借助冷冻电镜和Ribosolve解析了大小为28kDa（长度为88nt）的FSE结构，分辨率达0.69纳米，这是目前由单颗粒冷冻电镜技术获取的分子量最小的亚纳米级分辨率的生物分子结构。相关研究成果于年7月20日公布在生物研究预印本在线期刊BioRxiv上。
我们首先通过体外实验抑制FSE介导的核糖体移码活性。结果显示，反义寡核苷酸（ASO）可以抑制新冠病毒FSE介导的核糖体移码，影响新冠病毒在细胞内的复制。然而，ASO并不能完全抑制FSE活性。为了解决当前的局限性，我们通过冷冻电镜技术和Ribosolve来确定新冠病毒FSE的三维结构，并通过RNA纳米结构标记方法对其进行验证。起初，我们获得分辨率为0.69纳米的FSE解析结构，但是这个分辨率不足以分析碱基之间的相互作用。此外，在分析冷冻电镜数据的过程中，许多高异质性的构象会被过滤，得到的信息并不是完整的。为了获得精度更高、信息更全面的FSE结构，我们进一步使用Ribosolve来模拟RNA的三维结构，进而得到具有复杂分子折叠的分辨率为0.59纳米的拓扑结构，其5端穿过由3个茎环形成的中心孔洞，可能为重要的靶点区域。该研究揭示了新冠病毒基因组里面重要元件FES的三维结构，并为阐述功能的分子机制提供了结构基础。
解析Alpha-冠状病毒HCoV-NL63
刺突糖蛋白原位结构
Alpha-冠状病毒HCoV-NL63是一种有膜包被且在自然界中广泛存在的病毒。据统计，每年引起呼吸道疾病的病原体中约有10％为HCoV-NL63，与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-1）和新冠病毒类似，HCoV-NL63也是以血管紧张素转化酶2（ACE2）为受体感染人体，利用从病毒囊膜突出的刺突糖蛋白三聚体与ACE2结合，进而介导病毒与人体融合。
病毒表面的刺突糖蛋白是中和抗体的主要靶标，对疫苗设计和药物结构优化的研究至关重要。每个刺突糖蛋白包含2个区域：处于N-末端的S1亚基（负责与受体结合）；处于C-末端的S2亚基（介导单跨膜螺旋将刺突糖蛋白固定在病毒包膜上）。一旦刺突糖蛋白的S2亚基位点被宿主跨膜丝氨酸蛋白酶裂解而激活，刺突糖蛋白会从融合前构象转变到融合后构象。已有研究揭秘了纯化后的融合前刺突糖蛋白的胞外域结构，其结果显示S1亚基具有构象异质性及多个糖基化位点。
我们课题组借助单颗粒冷冻电镜技术从无化学固定剂的病毒体表面直接挑取刺突糖蛋白颗粒，经过三维重构，以0.34纳米的分辨率展示了HCoV-NL63刺突糖蛋白三聚体的原位结构，并清楚地看到蛋白表面的糖基化密度。这种结构为将来研究处于天然状态下的冠状病毒刺突糖蛋白与受体、抗体或药物结合研究奠定了基础。相关研究成果于年11月17日发表在《生物学评论季刊》（QRBdiscovery）上。
与新冠病毒相比，HCoV-NL63S1亚基具有1个额外的N-末端结构域，该域被认为是Alpha-冠状病毒的典型特征。新冠病毒的受体结合结构域（RBD）具有一定的灵活性，在向上（开放）和向下（闭合）构象之间转换，ACE2能够结合RBD的向上构象以启动病毒与受体的结合，而HCoV-NL63的RBD与结构域A相互作用，稳定在HCoV-NL63S1亚基的闭合“圆圈”中。因此，HCoV-NL63RBD上的3个受体结合基序（RBMs）被掩埋在结构域A和RBD之间的界面中，防止RBMs与ACE2的结合。此外，我们将HCoV-NL63和新冠病毒中的S2亚基结构进行了叠加，结果显示两者的S2亚基结构具有一致性。
利用标准配置的
冷冻电镜获取原子分辨率的
载铁蛋白结构
单颗粒冷冻电镜技术在解析膜蛋白和大型蛋白复合物结构方面已成为首选方法。然而，对药物的精确设计，则需要我们知晓精细的化学组成，由此要求结构的分辨率要达到原子级别（优于0.15纳米）。
我们课题组利用标准配置的冷冻电镜kVTitanKriosG3i结合K3（Gatan）或Falcon4相机获得分辨率分别为0.纳米和0.纳米的载铁蛋白结构。相关研究成果于年11月2日发表在《细胞研究》（CellResearch）杂志上。
该研究结果显示，具有原子级别分辨率的冷冻电镜结构清晰地展示了氨基酸侧链中的每个重原子（如C、N、O和S），并隐约可以看到氢原子的存在和位置。此外，我们还发现了某些残基具有多个旋转异构构型。在该研究中，我们更新了Q-score系统，使其适用于分辨率可达0.1纳米的结构数据。利用改进后的Q-score系统，我们对分辨率在0.纳米和0.纳米之间的载铁蛋白结构的可解析性进行了系统评估，结果显示，利用标准配置的冷冻电镜获得的载铁蛋白结构与其他近似分辨率的载铁蛋白结构相比具有同等的解析度。此外，我们还开发并改进了用于评估电镜结构质量的方法：水分子定位以及B’因子。其中，B’因子可以用于评估电镜结构中原子位置的不确定度，基于模型利用此因子可以计算得到一个与实验数据相同的结构。
张凯铭，美国斯坦福大学生物工程系研究员，致力于利用冷冻电镜技术解析生物大分子结构，揭秘生物分子相互作用的细节。
李珊珊，美国斯坦福大学生物工程系研究专员，致力于生物大分子结构的解析研究。
张凯铭将任职于中国科学技术大学特任研究员、博士生导师，获得中科院“率先行动”计划资助。课题组将利用冷冻电镜技术开展与重大疾病（如癌症、COVID-19、艾滋病）相关的RNA和RNA-蛋白复合物的结构研究，以助力开发和设计药物分子。同时，将开发利用冷冻电镜解析小分子量样品的方法，为快速药物筛选和开发提供平台。现拟招聘博士后1-2名，科研助理（实验室管理员）1名。博士后岗位待遇：根据中国科学技术大学博士后管理相关规定执行，包括工资、津贴、住房和子女入学入托等。优秀者在聘期结束后将进一步支持其事业发展。科研助理（实验室管理员）岗位待遇：参照中国科学技术大学项目聘用待遇，具体面谈，相关福利待遇按学校政策执行。有意向者请将简历（包括两封推荐信或两位推荐人的姓名和详细联系方式）发送至kmzhang
stanford.edu或kaimingzhang11gmail.