PCR与DNA聚合酶
PCR相关实验在现代生命科学研究中发挥着重要作用。在PCR相关实验中，会用到各种酶试剂，这些试剂关系到实验的成功与否。其中，DNA聚合酶在DNA和RNA的操控、合成和分析中都发挥着难以替代的作用，成为科学家们揭示分子生物学奥秘的有力的工具。
本期内容，盘点PCR实验中常用的DNA聚合酶试剂。
01
DNA聚合酶
PCR实验
DNA聚合酶（DNAPolymerase）参与DNA分子的合成过程。它在细胞中的主要功能是在DNA复制中负责合成新的DNA链。
DNA聚合酶使用DNA模板上的信息，根据碱基互补配对原则（A-T，C-G配对），从5→3，即从新链的5端到3端进行，在新链上加入互补的核苷酸。DNA聚合酶只能在已存在的DNA链上进行合成，因此需要一个起始点，称为引物（primer），来提供3端的OH基团，该过程一直持续到整个DNA链被复制完成。
除了PCR实验中，在生物体的细胞中，也有DNA聚合酶的参与，例如，帮助DNA损伤修复和维护基因组的完整性。
02
常见的DNA聚合酶
PCR实验
DNA聚合酶是一类酶的总称，有多种种类，每种都具有不同的特性和应用。
TaqDNA聚合酶
来源
从耐热细菌Thermusaquaticus中分离得到。
特点
耐热性：TaqDNA聚合酶的适宜工作温度通常在70°C至75°C之间。这使得TaqDNA聚合酶非常适合PCR反应，因为PCR需要在每个循环中通过高温步骤来分离DNA链。
5→3聚合酶活性TaqDNA聚合酶具有5→3聚合酶活性，即它能够在DNA链的5端到3端方向上合成新的DNA链。
没有3→5外切酶活性与一些其他DNA聚合酶不同，TaqDNA聚合酶不具备3→5外切酶活性，这意味着它缺乏校正能力，容易引入突变。因此，在PCR反应中，TaqDNA聚合酶的错误率相对较高。
DNA模板依赖性：TaqDNA聚合酶对于DNA模板的依赖性较强，需要引物（primer）提供3端的OH基团，作为新DNA链的起始点。
PfuDNA聚合酶
来源
从嗜热古细菌Pyrococcusfuriosus中分离得到。
特点
高度的3→5外切酶活性：PfuDNA聚合酶表现出高度的外切酶活性，使得其能够进行校对，纠正PCR反应中可能发生的错误。这有助于提高扩增产物的准确性。
高保真度：由于其强大的外切酶活性，PfuDNA聚合酶在PCR反应中具有更低的错误率，提供高度保真的DNA合成。
温度适应性：PfuDNA聚合酶在较高的温度范围内（通常在72°C至75°C）表现出较高的活性，适用于PCR反应的高温步骤。
缺乏5→3外切酶活性：与一些其他聚合酶不同，PfuDNA聚合酶通常不具备5→3外切酶活性，因此不会引入额外的5端修饰。
大肠杆菌DNA聚合酶
来源
从大肠杆菌（Escherichiacoli）中分离得到。
特点
多功能性：大肠杆菌中有三种不同类型的DNA聚合酶，即DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ，它们分别简称为PolⅠ、PolⅡ和PolⅢ。PolⅠ和PolⅡ的主要功能是参与DNA的修复过程，而PolⅢ的功能看来是同DNA的复制有关。
基因克隆：大肠杆菌DNA聚合酶在基因克隆中广泛应用，用于合成DNA片段、连接DNA末端，是DNA构建的关键工具之一。
PCR辅助：在PCR实验中，某些大肠杆菌DNA聚合酶的外切酶活性，比如：Klenow片段，可以用于扩增产物末端的修饰，例如A添加（A-tailing）。
低错误率：大肠杆菌DNA聚合酶通常具有相对较低的错误率，这在一些实验中是需要考虑的因素。然而，与一些高保真度的DNA聚合酶相比，其准确性可能较低。
T4DNA聚合酶
来源
来自噬菌体T4的DNA聚合酶，属于T4DNA复制和修复机制中的关键酶之一。
特点
5→3聚合酶活性：T4DNA聚合酶主要表现为5→3聚合酶活性，即在合成新的DNA链时，从DNA链的5端到3端方向进行。
3→5外切酶活性：T4DNA聚合酶还具有3→5外切酶活性，能够修剪单链DNA的3末端。在反向切除DNA片段时非常有用，例如在DNA修复和重组过程中。
缺乏核酸内切酶活性：与一些其他T4DNA复制酶不同，T4DNA聚合酶通常不具有核酸内切酶活性，因此不会切割双链DNA。
依赖于引物：T4DNA聚合酶在DNA合成时需要引物提供3端的OH基团，因此通常在反应中需要引物的引导。
DNA末端修饰：T4DNA聚合酶可用于在DNA末端进行修饰，例如通过添加dA（腺嘌呤）或dG（鸟嘌呤）来形成A悬垂末端或G悬垂末端。
好物推荐
PCR实验
德国MinervaBiolabs公司生产的TaqDNA聚合酶是一种高效的5‘→3’聚合酶，没有3‘→5’外切核酸酶活性。在72℃和pH9的条件下，MBTaqDNA聚合酶达到其最高水平的活性，能够在30秒内扩增1kbDNA。
Taq的活性在室温时被阻断，例如在准备样品时。当温度高于70℃时，Taq聚合酶的抑制被完全逆转。在94℃2分钟后聚合酶达到完全活化。MBTaqDNA聚合酶带有10x缓冲液，能获得更大产率和灵敏度，这应符合大多数标准应用。
MBTaq热启动DNA聚合酶推荐使用/范围：
常规和多重PCR；实时PCR；T/A克隆；生物素/地高辛或放射性核苷酸进行DNA标记；双链或单链标准DNA测序
