基因克隆是分子生物学中的一种基本的操作方法。本篇主要介绍双酶切法和同源重组法。
双酶切法构建载体
原理：
a.利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸
b.用两种不同的限制性内切酶切割靶基因,得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体。
c.在T4DNA连接酶作用下进行连接，从而实现基因克隆。
缺点：
（1）对引物的设计要求严格；引物的长度一般为18-25bp，GC含量控制在40%-60%，上、下游引物之间GC含量不能相差太大，引物中需要加入酶切位点及保护性碱基。引物设计不当可能在扩增时生成引物二聚体，给实验带来不便。
（2）目的基因有必要进行TA克隆。
（3）双酶切效率不高。
（4）连接效率低。
2.同源重组法构建载体
原理：
a.设计引物:
上游引物F：5’端前面加的是酶切位点（如HindIII）及该酶切位点在载体中对应前面的15个碱基载体片段（上游同源臂）；
下游引物R：5’端前面加的是酶切位点（如HindIII）及该酶切位点在载体中对应后面的15个碱基载体片段（下游同源臂）。
b.将载体进行单酶切(单酶切假阳性率很高)，使得载体成为两端带HindIII位点的线性载体；同时PCR扩增目的基因。
c.PCR产物直接用于重组连接，不需要酶切产生粘性末端，而且重组酶的重组能力强于T4DNA连接酶的连接能力，一般只需要一步即可重组连接成功，因此可以在重组反应之后进行测序鉴定。
缺点：
假阳性略高
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