脲酶(UE)又称脲胺水解酶;英文名称Urease;EC.3.5.1.3。脲酶(UE)是一种催化尿素水解成氨和二氧化碳的酶,具有高度专一性。脲酶广泛分布于植物的种子中,也存在于动物的血液和尿液中,某些微生物也能分泌脲酶。UE能够水解尿素产生氨和碳酸,对尿素转化起关键作用。利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N来反应UE活性。
一、概况
1.反应式
最适pH为6.0~7.3,依缓冲剂种类与酶源而变化[]
2.米氏常数
3.专一性
此酶对脲具有高度的专一性;刀豆类型脲酶也仅在一定程度上与1-羟基脲起反应。巴斯德氏芽孢杆菌(Bacilluspasteurii)类型脲酶对脲则表现出绝对的专一性。
4.激活剂与抑制剂
磷酸缓冲剂能激活此酶。重金属离子、羟基脲,羟胺、Na+K+、NH苏门灵(sumarin)以及硫脲皆为抑制剂。EDTA可络合Cu2+与Pb2+离子,因而对此酶有稳定作用。
5.纯度要求
所要求的纯度为每毫克蛋白含5~单位。
6.意义
脲酶主要用作测定脲的分析试剂,原来所规定的此酶活性单位为Sumner单位,即定为在20℃下,5分钟内能产生1x10~克氨基氮所需的酶量。一个Sumner单位相当于国际单位(U)
7.稳定性
纯化的酶不稳定,然而,粗制品酶在一定程度上是稳定的。含50%甘油的酶溶液于2℃保存,可稳定数月之久。
二、测定方法
1.电化法
有文献介绍了一种直接电位法测定脲酶,使用灵敏的贝克曼阳离子玻璃电极连续记录测量由脲产生的铵离子。有文献介绍了一种测定脲酶的方法,这是基于脲水解生成氨的原理。所产生的氨则以电量法滴定所产生的次溴酸盐,并以电流指示终点。在尿样品中,氨可以直接滴定;然而,在血液样品中,首先却要用微量扩散技术把氨分离出来。
有文献介绍了一种使用透气性氨专一电极的动力学法直接测定脲酶。在酶促反应过程中释放出的氨可连续进行监测,由此生成氨的速度与脲酶浓度成正比关系,此法的变异系数为2.8%。此法优点之处是,透气性电极表面不受血液样品中Na+或K+离子的干扰影响。
2.分光光度法
脲酶活性测定还可借助于生成铵离子,尔后,与次氯酸钠和苯酚钠溶液起反应,即可进行比色测定。所生成的蓝色靛酚,当发色最深时(约20分钟后),于或nm处进行测量。氨的含量在微克以下时,其吸光率与浓度之间呈线性关系。
目前,受到人们日益重视的一种方法是,采用与谷氨酸脱氢酶(GIDH,E.C.)相偶联的反应来进行测定,即于nm处跟踪NADH吸光率的减量。
该偶联反应的最适pH值为7.6,此测定反应变异系数为2.8%。
3.荧光法
谷氨酸脱氢酶偶联反应尚可适用于荧光法测定脲酶,当用强碱处理后便可用荧光法跟踪NADH减量(激发波长=nm,发射波长=nm);或者跟踪NAD的增量。
4.放化法
有文献介绍了一种测定脲酶的放射法,系采用碳-14标记的脲,所产生的含放射性CO气体,可用标准计数法进行测量。还有文献亦介绍了一种相似的放射测定方法。