摘要：硫通过形成各种含硫分子而成为所有生命的基本元素。相对于已经深入研究的生物学功能，目前对含硫分子生物合成过程中硫的引入机理的认识还很有限。创新霉素（Chuangxinmycin，1）是从济南游动放线菌中首次发现的含硫抗生素，具有新颖的吲哚骈二氢噻喃环（TPI）骨架结构，具有特异性靶向抑制细菌色氨酰tRNA合成酶（TrpRS）活性，是重要的新型抗生素候选分子。尽管此前报道了生物合成基因簇和最近报道的P酶负责C-S键形成，酶促硫掺入的机制仍然未知。本文通过对关键酶的体外生化表征来解决这一关键的生物合成问题，并在一锅酶反应中重建TPI骨架。本文发现JAMM/MPN+蛋白Cxm3作为一个去泛素酶样硫转移酶，通过与泛素样硫载体蛋白Cxm4GG相互作用催化非经典的硫转移反应。这一发现为自然界中的硫转移酶增加了一种新的机制。
杂志名：ANGEWANDTECHEMIE-INTERNATIONALEDITION-09-08
英文题目：Biosynthesisofchuangxinmycinfeaturingadeubiquitinase-likesulfurtransferase
作者：张兴旺,张友明教授，李盛英教授，卞小莹教授，张伟教授等
单位：山东大学微生物技术国家重点实验室；上海交通大学
含硫分子在自然界中具有重要的生理和生态功能。虽然已经发现了许多天然含硫化合物，但对硫引入的生物机制仍然知之甚少。在某些含硫分子的生物合成中，硫载体蛋白(SCP)在其保守的c端二甘氨酸尾部(GG-COO-)被激活为硫羧酸形式(GG-COS-)后通常作为直接的硫供体。硫转移酶需要通过形成硫转移酶?受体-底物?SCP复合物来催化硫从活化的SCP-GG-COS-转移到受体底物(图1A)。这种酶介导的硫转移反应对含硫分子的生物合成至关重要。在真核生物和古生物中，JAMM/MPN+蛋白通常作为去泛素酶(DUBs)，通过识别和裂解泛素基序(UB)，而UB基序与SCP在进化上相关，在结构上与SCP相似。含硫抗生素创新霉素(1;图1C)，最初于从Actinoplanestsinanensis中分离出来，是一种有效的选择性细菌色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)抑制剂。此前，1的生物合成基因簇和推测的生物合成途径已由我们和其他实验室独立报道。本文从起始原料出发，阐明并重构了TPI的组装途径。
图1：A:SM生物合成过程中典型的硫载体蛋白介导的硫引入循环。B:泛素化/去泛素化催化循环过程。C:创新霉素(1)的生物合成路径。
通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析，cxmj和Cxm4的反应产生Cxm4GG-COO-。Cxmm能够通过中间产物Cxm4GG-CO-AMP将Cxm4GG-COO-转化为Cxm4GG-COS-。因此，cxmj和cxmm共同介导Cxm4向Cxm4GG-COS-的转变（图2A）。Cxm3失活后就不产生1和相关含硫中间体，这强烈表明Cxm3在硫引入过程中发挥了重要作用。在Cxm3体外反应中将1完全转化为4,5和6（图2Bii）。本文证实了PLP-依赖的转氨酶Cxm7负责2到3的转化(图2C)。本文推断6可能是DTT-捕获的产物，可能来自于Cxm3催化硫转移反应中真实但不稳定的产物7(图2D)。
图2:A：Cxm4不同形式的ESI-MS分析。B：硫反应和Cxm6介导的还原反应的HPLC。C：Cxm7介导的反应的HPLC分析。D：4/5/6/7的转化网络。
基于人工智能依赖的结构建模和突变分析的结果，本文提出了Cxm3催化硫转移反应的机制（图3C）。
图3：A：Rpn11域和PfJAMM1叠加的Cxm3模型。B:Cxm3突变体的HPLC分析。C:cxm3介导的硫转移反应的可能机制。
接下来，细胞色素P酶Cxm5的催化功能在NADPH作为电子供体，以及铁氧化还原蛋白selfdx和铁氧化还原蛋白还原酶selfdr作为替代氧化还原伴侣的存在下重建(图4A).因此，Cxm5介导了C-S键形成反应，将4转化为3-去甲基创新霉素(10)(图1C)。
基于建立的单个TPI骨架组装生物合成步骤，本文在体外重建了2到10的生物合成途径（图4B）。
图4：A:cxm5催化反应的HPLC分析。B:HPLC分析2-10的体外转化。
结论（重要结果）：本文通过体外酶法阐明并重构了1中独特的TPI骨架的生物合成途径。一种新型JAMM/MPN+超家族酶Cxm3被表征为依赖于Zn2+的DUB-like硫转移酶。虽然众所周知JAMM/MPN+蛋白是SCPs或UBs的水解酶(图1)，但Cxm3作为硫转移酶的鉴定显然拓宽了JAMM/MPN+蛋白的化学性质。因此，本文推测dub样Cxm3和UB样Cxm4可能在原核生物的次生代谢中独立进化，除了真核生物和古生菌中的UB信号功能。1的生物合成之谜的解决突出了在自然界中创造含硫分子的有趣策略。本文的工作也为酶促生成TPI衍生物作为潜在的治疗药物奠定了分子基础。
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