无缝克隆是一种新型基因克隆技术，它可以同时将1到多个片段高效的插入到任何载体。目前应用较广泛的无缝克隆方法是GibsonAssembly和In-FusionCloning。这两种方法的在原理上非常相似：都是通过外切酶产生黏性末端、然后利用体内或体外重组酶进行连接，得到重组片段；但两者用到的酶却完全不同。我们一起来了解无缝克隆的秘密。
GibsonAssembly原理
GibsonAssembly是由DanielGibson和J.CraigVenter在年提出的。GibsonAssembly要求目的片段与线性化载体首尾具有一段互补重叠的同源臂序列；利用T5exonuclease的5’一3’外切酶活性产生3’黏性末端，之后同源臂进行互补配对，再利用DNApolymerase延伸补齐片段上的缺口部分，最后通过TaqDNALigase连接DNA片段中的缺刻，完成克隆组装。
GibsonAssembly原理示意图
In-FusionCloning原理
In-FusionCloning利用了In-Fusion酶能够识别3’末端碱基，具有3’→5’外切酶活性的特点。通过In-Fusion酶产生5’黏性末端，互补重叠片段退火配对；再将重组片段转化到感受态细胞内，重组片段序列中的缺刻在菌体内进行连接，获得重组序列。
In-FusionCloning原理示意图
无缝克隆的优势
传统的分子克隆技术依赖于Ⅱ型限制性内切酶和T4DNA连接酶的使用，DNA片段与载体经相同的限制性内切酶切割产生相同的末端，然后利用T4DNA连接酶反应实现片段融合。这种方法受到酶切位点限制，需选择片段与载体序列内部没有、而仅在载体多克隆位点存在的酶切位点。酶切连接的方法一次只能连接单个片段，无法实现多片段同时连接。且该方法中T4DNA连接酶的辅助因子ATP易失活，影响克隆效率。无缝克隆与传统的酶切连接相比，具有以下优势：
不受酶切位点限制
适用于任意载体、任意片段
一步连接1或多个片段，连接多片段耗时短
插入目的片段两端不会添加额外序列（如保护碱基）
无缝克隆实验关键影响因素
自无缝克隆技术被大家认识后，得到了众多老师的青睐，但同时也有部分质疑：连接效率为何总是不尽如人意？我们来细数影响无缝克隆实验的关键因素有哪些？
无缝克隆实验流程
片段质量
确保DNA片段无核酸酶及其它酶污染、无乙醇等残留；
纯度正常：A/A值在1.6-1.9、A/值在2左右、紫外吸收峰图正常；
浓度正常：插入片段与线性化载体浓度高于50ng/μl，会使重组效率提高；
若模板浓度低、纯度低，则连接效率降低。
载体线性化方法
线性化载体可以选择反向PCR或酶切的方法：
可根据在载体插入位置是否有合适的酶切位点选择具体方法。因GibsonAssembly反应体系内无双链DNA连接酶，不会发生载体自连，线性化载体不需要进行末端去磷酸化处理。酶切制备线性化载体建议使用双酶切，且酶切后采用胶回收的方法回收产物，这样利于降低假阳性。
若没有合适酶切位点或者多次酶切制备线性化载体均不成功，可以选择反向PCR扩增，但不适合较大质粒，如超过8kb。引物设计
目的片段引物设计：目的片段引物是由目的片段两端序列加同源臂序列组成，同源臂长度设置在16-45bp，Tm值在58–65°C。同源臂越长，有利于重组置换，但可能会影响目的片段扩增；
载体引物设计：确定目的片段插入位置，推荐借助Snapgene软件设计反向PCR引物。
PCR扩增
反向PCR制备线性化载体及扩增目的片段时需要使用高保真酶；
制备线性化载体后使用DpnI内切酶消化环状质粒模板，降低假阳性克隆。
插入片段与线性化载体摩尔比
10μl反应体系，载体与插入片段总加入量建议在0.01-0.3pmol。插入片段与线性化载体的最佳摩尔比为1:1-4:1；片段与片段的摩尔比为1:1。
推荐使用GenStar克隆连接反应体系计算工具（gene-star.
